Диффузиялық преципитация реакциясы (ДПР

Белгілі қойылған нақты мақсаттарға байланысты әртүрлі диаметрлі, санды тескіштерімен штамптар қолданылады. Дайындалатын ойықтардың бір-бірінен ара қашықтықтары да алдын ала тәжірибе жүзінде анықталады. Белгілі мақсаттарға байланысты ортадағы ойыққа иммунды қан сарысуын енгізеді, ал шеткілерге – зерттелінетін антигендер немесе керісінше қоюға болады. Құйылған компонеттер ойықтың сыртына, агардың бетіне шықпауы керек. Содан соң пластиналарды эксикаторға орналастырады. Эксикатордың түбіне антисептик араласқан аздаған су құяды. Пластиналарды компоненттерімен бөлме температурасында 10-72 сағат ұстайды.

Гелдегі преципитация реакциясын Петри табақшасында және заттық шыныда (агардағы микропреципитация) қояды. Гель ретінде агар-агар, желатин т.б.пайдаланылады.

Диффузды преципитация реакциясының көмегімен зерттелінетін қан сарысуындағы антиденені және оның титрін анықтауға болады. Бұл жағдайда орталық ойыққа белгілі ерігіш антигенді (бактериальді, вирусты) ал сыртқы ойықтарға – зерттелінетін қан сарысуының әртүрлі сұйылтуларын құяды.

Комплементті байланыстыру реакциясы (КБР)
Сабақтың мақсаты. Студенттерді комплементті байланыстыру

реакциясының механизмімен, қою жолдарымен және нәтижелерін бағалаумен таныстыру.

1. Гемолизинді және комплементті титрлеу, олардың жұмыс титрлерін табу. 2. КБР-дің басты тәжірибесін қою және реакцияның нәтижесін есепке алу.

1. Комплементтің сипаттамасы (теңіз шошқасының комплементі). Комплементті косервациялау қалай жүргізіледі?

2. Иммунды гемолиздің мәні неде?

3. Гемолизинді және комплементті титрлеу дегеніміз не?

4. КБР-дің негізгі (басты) тәжірибесін қоюдың жолы қандай?
Классикалық комплементті байланыстыру реакциясы (КБР) . КБР-дің принципі (қағидасы). Тегі және қасиеті. Комлемент гуморалдық иммунитеттің аса маңызды іс атқаратын ерекше қорғаныс факторы. Комплементті 1899 жылы француз ғалымы Ж.Борде ашып “алексин” деп атаған. Комплемент деген атты Г.Эрлих ұсынған.

Комплемент антиген (АГ) мен антидене (АД) қосылған кезде белсендірілетін, жай кезде енжарлы жағдайда болатын сарсудың ақуыздарырының күрделі кешені.

Комплементтің құрамына 20-дан астам ақуыз түрі кіреді. Оның ішінде 9 түрі ең негізгісі болып саналып С1, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9 әріп-цифрлармен белгіленеді. Комплементтің ақуызы глобулиндер қатарына жатады және өзара физикалық-химиялық көрсеткіштерімен жекелендіріледі. Мысалы, олардың молекулалық салмағы және де күрделі суббірліктік құрамы болады. Комплемент бөлшектері жоғарғы концентрацияда синтезделеді (сарысу ақуызының 5-10 пайызы комплемент), сонымен қатар,оның бір бөлігін фагоциттер бөліп шығарады.

Комплемент антигенмен немесе антиденемен жеке –жеке байланыспайды. Реакция барысында клетканы талқандайтын (соматикалық, бактериялық – антиген болатын) АГ+АД+С компоненті түзіледі. Антиденелер мен комплементтің әсерінен антигендердің бұзылуын иммунды лизис деп атайды.

Диагностикалық серологиялық комплементті байланыстыру реакциясы (КБР) иммундық лизис феноменіне негізделген. КБР-да корпускулярлы және ерігіш антигендерді қолдануға болады. КБР-да АГ-АД жүйесі және комплемент қатысады.

1-ші жүйе (АГ+АТ) - зерттелінетін. Бұнда компоненттердің бірі (АГ немесе АД) ізделіп отырған болады. Комплементтің (С) бұл жүйемен байланысуы кез келген жағдайда да, ешқандай көзге көрінетін (агглютинация, преципитация) феноменін бермейді.

2-ші жүйе (АГ+АТ) – индикаторлық. Бұл жүйе қой эритроциттерінен (антиген) және гемолизиннен (қой эритроциттеріне қарсы антидене) тұрады. Комплементтің (С) бұл жүйемен (АГ+АТ) байланысуы, оптикалық құралсыз көрінетін, эритроциттердің иммунды лизисімен (гемолиз) сипатталады.

Комплементті зерттелінетін де (1-ші жүйе), индикаторлық жүйе де (2-ші жүйе) белсендіре алады. КБР осы екі жүйенің комплементке конкуренциясына (бәсекелестігіне) негізделген. Осы себепті реакцияны екі этапта (фазалар) қояды. Бірінші этапта пробиркаға зерттелінетін компонентті, мысалы – қан сарысуын, белгілі антигенді және теңіз шошқасының комплементін құяды; компоненттер қосындысын (зерттелінетін жүйе) 37-38оС температурада су моншасына қояды. Екінші этапта – зерттелінетін жүйеге индикаторлық жүйені (қой эритроциттері (антиген) және гемолизин (қой эритроциттеріне қарсы антидене) қосады, қоспаларды тағы да су моншасында ұстайды. Осыдан кейін реакция нәтижесінің «оң» немесе «теріс» екендігін анықтайды.

Реакцияның теріс-нәтижесінде: зерттелініп отырған қан сарысуына (антидене) белгілі микроб антигенін және комплементті қостық. Зерттелінген қансарысуында антиденелер – жоқ. АГ-АД-С комплексі түзілмейді. Комплемент (С) белсенді түрде қалады. Ол индикаторлық жүйені қосқанда эритроциттерді лизистейді (гемолиз). Реакцияның нәтижесі – гемолизді көреміз, КБР -«теріс». Яғни, зерттелініп отырған қан сарысуы сау малдыкі деп қорытындылайды.

Реакцияның оң-нәтижесінде: зерттелінген қан сарысуында антиденелер – бар. АГ+АД+С комплексі түзіледі. Белсенді комплемент – жоқ. Ол индикаторлық жүйені қосқанда эритроциттерді лизистемейді (гемолиздемейді). Реакцияның нәтижесі – гемолиз - жоқ, КБР -«оң». Яғни, зерттелініп отырған қан сарысуы ауру малдыкі деп қорытындылайды.

Комплементті байланыстыру реакциясының (КБР) компоненттері. КБР-дің бес компоненттері бар.

Қошқардың эритроциттері - дефибринденген эритроциттерді физиологиялық ерітіндімен центрифугалау арқылы жуады. Әдетте, реакцияға эритроциттердің физиологиялық ерітіндідегі 2,5%-дық жүзіндісін қолданады.

Гемолизин. Бұл - қошқардың эритроциттерімен иммунделген қоянның қан сарысуы (эритроциттерге антиденесі бар).

Комплемент –теңіз шошқасының қан сарысуы. Биофабрикаларда лиофильденген түріде шығарылады.

Антиген- биофабрикаларда диагностикалық антигендер КБР үшін арнайы дайындалады. Антиген салынған қораптардың сыртына, КБР қоюға ұсынылған оның белсенділігі (антиген титрі) сұйылту дәрежесімен көрсетіледі.

Зерттелінетін қан срысуы – әрбір қан сарысуын 1:5 қатынасында физиологиялық ерітіндімен сұйылтады. Қан сарысуында болатын әр малдың өз комплементін жою үшін оны су моншасында жылытады (инактивациялайды): сиырдың қан сарысуын – 60-62оС, жылқыныкін – 56-58оС, қодастыкін – 62-64 оС, есек пен қашырдыкін – 64-65 оС, қой мен ешкінікін – 58-60 оС - 30 минут, шошқаныкін – 60-62 оС – 50 минут қыздырады.

Реакция компоненттерін сұйылтуға Ca2+ және Mg2+ иондары бар физиологиялық ерітінді пайдаланылады.

Ветеринариялық практикада КБР-ді серологиялық диагностика әдісі ретінде қолданады. Бұл жағдайда реакцияның стандартты емес (түрліше) компоненті болып - зерттелінетін қан сарысуы есептеледі. Себебі ондағы ізделініп отырған антиденелердің мөлшері әр қилы – нөлден бастап өте жоғары мөлшерде болуы ықтимал. Шынайы нәтижелерді алу үшін барлық компоненттерді (эритроциттер, антиген, гемолизин, комплемент) реакцияға оптимальді сандық арақатынастарда енгізу керек. Көрсетілген компоненттердің оптимальді концентрацияларын табу оларды титрлеу деп аталады. (Кестелер)

Гемолизинді титрлеу.

КБР-ді әртүрлі көлемде (мөлшерде) қоюға болады: 1,0 мл (әр компонентті 0,2 мл-ден); 2,5 мл (әр компонентті 0,5 мл-ден) және микромөлшерде. Мысалы, КБР –ді 1,0 мл көлемде қоятын болсақ, онда гемолизинді мынадай жолмен титрлейді. Бірінші кезеңде гемолизиннің қосалқы сұйылтуларын 1-ші кесте бойынша дайындайды және 0,2мл-ден әр сұйылтудан бос пробиркаларға ауысырады.

Кесте -1 Гемолизиннің қосалқы сұйылтылған қатарын дайындау

Компонент	Пробиркадағы компонент саны (мл)
	1-ші	2-ші	3-ші	4-ші	5-ші	6-шы	7-ші	8-ші
Физиологиялық ерітінді	0,8	0,9	1,4	1,9	2,4	2,9	3,4	3,9
Гемолизин 1:100 сұйыл-н	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Гемолизиннің алынған сұйылтуы	1:500	1:1000	1:1500	1:2000	1:2500	1:3000	1:3500	1:4000

Сонан соң бұл пробиркаларға 0,2 мл-ден комплемент, эритроциттер жүзіндісін және 0,4 мл-ден физиологиялық ерітіндіні - антиген мен зерттелінетін қан сарысуының орнына қосады (кесте-2). Компоненттерді шайқап араластырады, су моншасына 10-15 мин қойып нәтижесін есепке алады.

Кесте-2 Гемолизинді титрлеу

Гемолизиннің титрі болып – оның ең жоғарғы сұыйылтуының комплементтің оптимальды мөлшерінің қатысуымен эритроциттер суспензисын толық гемолиздейтін мөлшері есептеледі. Біздің мысалымыздағы гемолизиннің титрі 1:2000 –ге тең (4-ші пробирка). КБР қою үшін гемолизиннің екі есе арттырылған санын алады – бұл жағдайда 1:1000 сұйылтылуы немесе бұны гемолизиннің жұмыс титрі деп атайды. Гемолизинді титрлеуді оның зертханаға жаңадан келген серияларымен немесе оларды ұзақ уақыт сақтағанда жүргізеді.(Сақтау кезінде оның белсенділігі өзгеріп кетеді).

Антигенді титрлеу. КБР-де антигендерді макимальды белсенділік көрсететін және де антикомплементарлылығы жоқ сұйылтуында қолданады. Бұл дозаны антигеннің жұмыс дозасы деп атайды. Антикомплементарлық қасиеті деп антигеннің комплементтің белсенділігін басу қасиетін айтады. Антигеннің жұмыс титрін алдын-ала белгілі «оң» қан сарысуымен, яғни осы антигенге сәйкес антиденесі бар қан сарысумен анықтайды. Антигенді титрлеуді сирек жүргізеді.

Комплементті титрлеу. Комплементтің қасиеті жылдам өзгеретіндіктен оның титрін әр уақытта, КБР-дің басты тәжірибесін қойған күні міндетті түрде анықтайды. Комплементтің титрі деп оның минимальды санының, гемолизиннің жұмыс дозасының қатысуымен, эритроциттердің жүзіндісін толық гемолиздейтін мөлшерін айтады. Комплементті реакцияның гемолитикалық немесе бактериолитикалық жүйесінде титрлейді. Гемолитикалық жүйедегі титрлеу деп комплементтің титрін индикаторлық жүйенің (эритроциттер+гемолизин) қатысуымен , бірақ зерттелінетін қан сарысуынсыз және антигенсіз (бұлардың орнына бірдей көлемде физиологиялық ерітіндіні қосады) анықтауды айтады. Гемолитикалық жүйеде комплементті титрлеу, мысалы, егер реакцияны 1 мл көлемде қоятын болса, мына кестедегі (3-ші кесте) көрсетілген жолмен, атқаруға болады.

Біздің мысалымызда, эритроциттердің толық гемолизі комплементтің 0,1 мл минимальды дозасында байқалып тұр. Бұл оның титрі болып есептеледі. Комплементтің белсенділігін антиген және зерттеліп отырған қан сарысуы (антикомплементарлық әрекеті) төмендетуі мүмкін. Компоненттердің антикомплементарлық әсерінен құтылу үшін, тәжірибеге комплементті белгіленген титрден 20-40% көп алады. Титрді өте жоғары дәлділікте анықтау үшін комплементтің титрін қан сарысуы мен антигеннің қатысуы арқылы анықтау керек (бактериологиялық жүйеде титрлеу).

Бактериологиялық жүйеде комплементті титрлегенде оның титрі ретінде, оның минимальды санының негативті сарысуы және антигені бар пробиркада, және де антигенсіз позитивті сарысу бар пробикаларда эритроциттердің суспензиясын толық гемолизге ұшырататын дозасын айтады.

Реакцияның бірінші фазасын 2-6оС температурада 16-18 сағат аралығында ұстау реакцияның сезімталдығын арттырады. КБР-дің мұндай вариантын Комплементті Ұзақ байланыстыру реакциясы (КҰБР) деп атайды. КҰБР –да комплементті екі еселенген мөлшерде алады.
Кесте – 3 Гемолитикалық жүйеде комплементті титрлеу

Компо нент	Пробиркадағы компонент саны (мл)
	1-ші	2-ші	3-ші	4-ші	5-ші	6-шы	7-ші	8-ші	9- шы	10-шы
Компле мент 1:20	0,02	0,04	0,06	0,08	0,1	0,12	0,14	0,16	0,18	0,20
Физиоло гиялық ерітінді	0,58	0,56	0,54	0,52	0,5	0,48	0,46	0,44	0,42	0,4
Индикаторлық жүйе	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
37оС -10 минут, су моншасында ұстау
Нәтижеле рін есепке алу	ГЖ	ГЖ	ЖГ	ЖГ	ТГ	ТГ	ТГ	ТГ	ТГ	ТГ

Ескертпе: ТГ- толық гемолиз; ЖГ – жартылай гемолиз; ГЖ- гемолиз жоқ.

4-ші кесте -КБР-дің негізгі тәжірибесін қою

Әрбір қан сарысуын пробиркаға КБР барлық компоненттерін қосып (1-ші пробирка, антигендік қатар) және антигенсіз (4-ші пробирка, антигенсіз қатар) зерттейді. Антигенсіз қатардың пробиркасы зерттелінетін қан сарысуының міндетті антикомплементарлық бақылауы болып есептеледі. Зерттелетін қан сарысуынан басқа бақылау ретінде алдын-ала белгілі позитивті және негативті қан сарысуларын тексереді. Олар КБР-де сәйкесінше «оң» және «теріс» реакция берулері тиіс. №5, 6, 7 пробиркалар -антигеннің, индикаторлық жүйенің, комплементтің және физиологиялық ерітіндінің дұрыс дайындалғандығына бақылау пробиркалар. Барлық қан сарысуларын реакция қояр алдында 1:5 сұйылтады, су моншасында (56-64оС) инактивтейді.

КБР-дің нәтижесін тіркеуді бақылау пробиркаларынан бастайды:

7-ші пробирка – физиологиялық ерітіндінің бақылауы: гемолиз болмау керек;

6-шы пробирка – индикаторлық жүйе мен комплементтің бақылауы: толық гемолиз болуы тиіс;

5-ші пробирка – антигеннің бақылауы: толық гемолиз болуы тиіс;

3-ші пробирка – «теріс» қан сарысуының бақылауы: толық гемолиз болуы тиіс;

2-ші пробирка – «оң» қансарысуының бақылауы: гемолиз болмауы (гемолиздің тежелуі) тиіс.

Егер жоғарыда көрсетілген бақылаулар реакция компоненттерінің дұрыс дайындалғанын, дәл дозасы екенін куәландырса онда зерттелініп отырған қан сарысуының нәтижесін есепке алады.

Әуелі, 4-ші пробирканы (антигенсіз қатар) – сарысудың антикомплементарлығына бақылау, қарайды. 4-ші пробиркада толық гемолиз болса (антикомплементарлығы жоқ) онда 1-ші пробирканы (антигендік қатар) қарауға болады. Бұл пробиркада толық гемолиз (реакция – теріс) немесе гемолиздің тежелуі (реакция – оң) болуы мүмкін. Егер тексерілініп отырған қан сарысуы антикомплементарлы болса, онда 1-ші пробирканың нәтижесін есептеуге болмайды, бұл жағдайда сол малдан қайтадан қан алып сарысуын зерттеу керек. Алдын ала КБР-дің нәтижесін бірденнен 2-ші фазадан кейін есепке алады да, қорытынды нәтижесін 18-20 сағаттан кейін жүргізеді, бұл кезде гемолизденбеген эритроциттер пробирканың түбіне шөгеді.

КБР-дің нәтижесін пробиркадағы эритроциттердің гемолизденуі немесе гемолиздің тежелуімен бағалайды. Гемолиз деңгейін крест (+) таңбасымен ажыратады:

4 крест (++++) – гемолиздің толық тежелуі (эритроциттер пробирка түбіне шөккеннен кейін сұйық мөлдір күйінде болады;

3 крест (+++) – гемолиздің тежелуі айқын көрінеді, (эритроциттер пробирка түбіне шөккеннен кейін сұйықтық әлсіз қызғыл болып көрінеді);

2 крест (++) - гемолиздің жартылай тежелуі (эритроциттер пробирка түбіне шөккеннен кейін сұйықтық қарқынды қызыл түсті болып көрінеді);

1 крест (+) – гемолиздің әлсіз тежелуі (эритроциттердің тұнбасы болар-болмас, мардымсыз, сұйықтық қарқынды қызылға боялған)

(-) – толық гемолиз, эритроциттердің тұнбасы жоқ.

Комплементті байланыстыру реакциясының схемасы және нәтижесі