Қазақстан республикасы ауыл

230
2 Леонова М.В. Экстракционные методы изготовления лекарственных средств из 
растительного сырья: учебно-методическое пособие [Текст]: М.В. Леонова, Ю.Н. Кли-
мочкин – Самара, Самар. гос. техн. ун-т. -2012. – 111 с.
3 Современные тенденции развития технологий здоровьесбережения [Текст]:
Электронный сборник статей по материалам ежегодной образовательной конференции с 
Международным участием. – Москва: Изд. «ГБПОУ ДЗМ МК № 2». – 2022. –№1.
4 Самбукова Т.В., Овчинников Б.В., Ганапольский В.П., и др. Перспективы исполь-
зования фитопрепаратов в современной фармакологии [Текст]/ Самбукова Т.В., Овчинни-
ков Б.В., Ганапольский В.П., и др. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарствен-
ной терапии. – 2017. – Т. 15. – №2. – С. 56-63. 
5 Elalfi Z. Chemical composition, antimicrobial and antibiotic potentiating activity of 
essential oils from 10 tropical medicinal plants from Mauritius.Aumeeruddy [Текст]/ Elalfi 
Z.,Gurib-Fakim A.,Mahomoodally M.F.//Journal of Herbal Medicine-2016- 6(2)- Р.- 88–95
УДК 57.083.3
ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ 
СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ С МАРКЕРАМИ
Токушев А.А. магистрант Ⅰ курса 
Казахский агротехнический исследовательский университет им. С.Сейфуллина
г. Астана
Иммунохроматографический тест (ИХА) используется для экспресс-диагностики и 
обнаружения чужеродных антигенов и молекул в биологическом материале и зарекомен-
довал себя как специфичный и чувствительный метод. ИХА находит широкое примене-
ние в медицине, ветеринарии, а также в сферах по производству сельскохозяйственной и 
пищевой продукции [1,2,3,4]. 
Потребность производства ИХА тестов обусловлено тем, что они могут вооружить 
медицинских и ветеринарных врачей быстрыми, точными и доступными методами диа-
гностики инфекционных болезней человека и животных, а также обеспечить контроль 
качества сельскохозяйственной и пищевой продукции. 
Согласно совместному докладу ВОЗ, ООН и МЭБ за 2019 год, инфекционные заболе-
вания вызванные устойчивостью к антимикробным препаратам и антибиотикам, могут 
стать причиной 10 млн смертей каждый год по всему миру и потерей экономического 
объема производства на сумму более 100 трлн. долларов к 2050 году. Кроме того, тести-
рование на наличие токсинов, и различных загрязняющих веществ может предотвратить 
возникновение новых проблем для здоровья населения в мире [5,6].
Среди всех иммунохимических тестов, ИХА относится к наиболее удобным и рас-
пространенным методам, так как не требует специальных навыков и знаний, он может 
быть выполнен в полевых условиях [7].
В основе ИХА-теста используются три типа антител: конъюгат, который представля-
ет из себя подвижные моноклональные (МКА) или поликлональные антитела (ПКА) к 
исследуемому антигену сшитые с меткой – коллоидное золото (КЗ), антитела к исследу-
емому антигену, иммобилизованные в аналитической зоне и вторичные антитела (анти-
видовые) иммобилизованные в контрольной зоне [8]. 
Целью наших исследований является определение оптимальных условий для получе-
ния конъюгатов специфических антител с маркерами, которые могут быть использованы 
для конструирования ИХА-тестов для экспресс-обнаружения антигенов
 Campylobacter 
jejuni.

231
Материалы и методы исследований. Поликлональные антитела полученные к эпито-
пам рекомбинантного белка внешней мембраны
Campylobacter jejuni 
МОМР32, золотох-
лорводородная кислота HAuCl4 (Sigma USA), цитрат натрия (Sigma USA), дистиллиро-
ванная вода, 1% BSA, Tris HCI (Thermo Scientific).
В качестве метки для специфических антител использовали коллоидное золото, син-
тез которого проводили по методу Френса [9]. 
Конъюгирование специфических поликлональных антител с наночастицами золота 
проводили путем проведения последовательных этапов.
1. В пробирку вносили раствор коллоидного золота, pH раствора доводили до значе-
ния 9,5;
2. К коллоидному раствору добавляли специфическими антителами. Сыворотка до-
бавляется каждую минуту и объем общего раствора доводится до определенного значе-
ния;
3. Блокировка. В пробирку с раствором наливается BSA 1% + HCI в зависимости от 
объема исходного раствора. Сыворотка с коллоидным золотом оставляется на блокиров-
ку на 30 мин;
4. Полученный конъюгат центрифугировали 20-30 мин при 10000-12000 оборотов в 
минуту.
С целью определения оптимальных условий получения конъюгатов специфических 
антител с меткой были осуществлены попытки получения раствора коллоидного золота 
(20нм) и его конъюгирования со специфическими антителами при разных условиях (та-
блица 1).
Таблица 1 – Условия получения коллоидного золота и конъюгирования с антителами
Вариант эксперимента
Результат
Отсутствие вторичной стерилизации 
царской водкой
Коллоидный раствор приобретает 
красный цвет
Увеличение концентрации ЗХВК до
0,02-0,03%
Коллоидный раствор приобретает 
насыщенный красный цвет 
Увеличение концентрации цитрата натрия 
до 1,5-2%
Коллоидный раствор приобретает 
бледный винный цвет 
Уменьшение концентрации цитрата 
натрия до 0,5%
Коллоидный раствор приобретает 
насыщенный красный цвет 
Снижение показателей pH ниже 9,5
Раствор становится слишком кислотным 
из-за чего невозможна блокировка конъю-
гата
В результате проведения различных вариантов эксперимента, были определены опти-
мальные концентрации и значения pH для получения конъюгатов специфических анти-
тел с маркерами. 
Отработана методика получения коллоидного золота из золотохлорводородной кис-
лоты. Получены два образца коллоидного золота с размером наночастиц 20 и 60 нм, наи-
большей активностью обладает коллоидное золото с размером частиц 20 нм. Эти наноча-
стицы коллоидного золота были использованы в дальнейшей работе. 
Оптимальные параметры получения конъюгированных препаратов КЗ и специфиче-
ских антител были следующими: концентрация антител 10-16 мкг/мл, объем 3 мл, рН 
буфера 6,5. При тестирование конъюгата приготовленнго по данной методике была вы-
явлена его высокую активность и чувствительность (2,5 мкг/мл). 
Для изучения активности полученных конъюгатов, проводили тестирование в dot- ва-
рианте ИФА. Постановку ИФА проводили по следующей методике: на полоски нитро-
целлюлозной мембраны наносили микропипеткой по 1 мкл антигена в концентрации (40 

232
мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,2 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,3 мкг/мл). 
После полного высыхания антигена, проводили блокировку свободных участков 0,1% 
BSA. Отмывку проводили трехкратно PBS×1 c Tween20, затем полоски помещали в про-
бирку с конъюгатами и инкубировали 30 минут при комнатной температуре. 
Для обнаружения антигена нитроцеллюлозные полоски помещали в чашки Петри и 
инкубировали в растворе конъюгата, рН 8,2. Взаимодействие коньюгата с антигеном, на-
блюдали в виде точек розового цвета в местах специфического взаимодействия через 3-5 
мин. Интенсивность окрашивания постепенно усиливалась в течение 1 часа. Чувстви-
тельность конъюгата в dot- варианте ИФА составила около 2,5 мкг/мл.
В результате проведенных иследований установили, что методика получения КЗ при-
годна для приготовления специфических конъюгатов, а оптимизация условий конъюги-
рования позволят получить конъюгаты, обладающие высокой чувствительностью и спец-
ифичностью по отношению к АГ.
Таким образом, конъюгат, приготовленный по предложеной методике, может быть 
использован при конструировании ИХА тестов. 

жүктеу/скачать 5,46 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: