Қазақстан республикасы ауыл
жүктеу/скачать 5,46 Mb. Pdf көрінісі
|
СЧ 2023 том 1 часть 2
| C. jejuni.
Материалы и методы. В работе были использованы рекомбинантные антигены C. jejuni МОМР32 и ОМР18 полученные в лаборатории иммунохимии ТОО «Националь- ный центр биотехнологии» МЗ РК, полный и неполный адъюванты Фрейда, забуферен- ный физиологический раствор (ЗФР), мыши линии Balb/c, миеломная линия клеток Х63Ag8.653, ПЭГ 4000, среда для культивирования RPMI 1640 Medium (Sigma-aldrich), фетальная сыворотка плода (ThermoScientific). Гибридизацию клеток миелом с клетками иммунных спленоцитов проводили по ме- тоду Oi V. & Herzenberg L. [9]. Тестирование культуральной жидкости проводили мето- дом непрямого варианта ИФА. Иммунизацию линейных мышей проводилипутем внутрибрюшинного введения ан- тигенов в дозе 0,1мл на голову с концентрацией белка 25 мкг/мл. Иммунизацию мышей проводили по короткой схеме, включающей в себя пятикратное парентеральное введение препарата с полным и неполным адъювантами Фрейда в 1 и 7 день иммунизации соот- ветственно и с забуференным физиологическим раствором на 11, 12, и 13 дни иммуни- зации. На 17-ый день после начала иммунизации проводили отбор сывороток крови для тестирования. Тестирование в иммуноферментном анализе проводили по стандартной методике. Сенсибилизацию лунок планшетов проводили рекомбинатными белками МОМР32 и ОМР18 в концентрации 0,001 мг/мл и инкубировали в течение 14 часов при 4℃. По результатам тестирования было выявлено, что в ответ на введение рекомбинантных бел- ков в организме у подопытных животных выработались антитела заданной специфично- сти. При этом максимальные титры специфических антител составляли 1:25 600 и 1:12 800, соответственно. Высокие титры антител у иммунизированных животных позволи- ли начать работу по гибридизации иммунных спленоцитов с миеломной линей клеток Х63Ag8.653. Выделение иммунных спленоцитов проводили в условиях ламинарного бокса, пу- тем вымывания В-лимфоцитов методом перфузии из селезенки иммунизированных мышей. Подсчет клеток производили в камере Горяева. Клетки миелом Х63Ag8.653 извлекали из жидкого азота, размораживали, культивиро- вали на питательной среде, затем смывали со дна культурального матраца и подсчитыва- ли в камере Горяева. Гибридизацию (слияние) клеток миелом и В-лимфоцитов проводили в присутствии ПЭГ 4000, соотношение клеток составляло 1:10 соответственно. После гибридизации 194 суспензию клеток по 0,1 мл разносили в лунки 96-ти луночных планшет для культиви- рования. Лунки планшетов предварительно покрывали клетками перитонеальных макро- фагов, которые являются питающим слоем. Планшеты помещали в СО2-инкубатор с по- стоянным присутствием 5 % углекислого газа при температуре 37℃. Через 24 часа после гибридизации вносили селективную среду «HAT» (Sigma), на 7 сутки проводили замену селективной среды на «НТ». Скрининг роста гибридных клеток и определение их физиологического состояния осуществляли путем ежедневного просмотра планшетов под инвертированным микро- скопом « Micros » рисунок 1. Рисунок 1 – Скрининг роста гибридных клеток В результате просмотра под микроскопом, на 10 день после проведения гибридизации было обнаружено пять гибридных клонов. Далее, в более поздние сроки, клоны продол- жали появляться, максимальное количество клонов было зафиксировано на 19-е сутки. Динамика клонообразования в зависимости от срока культивирования представлена в таблице 1. Таблица 1 – Динамика клонообразования в зависимости от сроков культивирования Количество суток после гибридизации Выход клонов, % Количество клонов % - от общего количества 10-е сутки 5 1,3 15-е сутки 37 9,6 19-е сутки 63 16,4 Культуральную жидкость из лунок, в которых зафиксирован рост гибридных клеток, тестировали в ИФА на наличие специфических антител к исходному антигену. В лунки планшетов, из которых была отобрана культуральная среда для тестирования, добавляли равное количество полной ростовой среды. Далее культивирование клеток проводили только на полной ростовой среде, включающей в свой состав 10%-ную фетальную сы- воротку. Тестирование гибридом на антительную продуктивность начинали проводить, когда наблюдалось незначительное пожелтение ростовой среды и клетки гибридом за- нимали более 30% поверхности лунок планшета. Всего на 19-е сутки было выявлено 63 гибридных клона, что составляет 16,4% от общего количества потенциально возможного образования клонов. При тестировании выявлено восемнадцать гибридных клонов, продуцирующих специфические иммуногло- булины к рекомбинантным белкам МОМР 32 (4,7%). Таким образом, в результате слияния клеток Х63Ag8.653 с клетками иммунных спле- ноцитов мышей, получено 18 гибридных клонов, продуцирующих специфические имму- ноглобулины к рекомбинантным белкам МОМР 32. Проведен отбор и культивирование положительных клонов. |