Метод электронного парамагнитного резонанса в исследованиях свойств биосистем
2008
План лекции
История открытия метода ЭПР
Метод ЭПР является основным методом для изучения парамагнитных частиц присутствующих в биологических системах. К парамагнитным частицам имеющим важное биологическое значение относятся два главных типа соединений - это свободные радикалы и металлы переменной валентности (такие как Fe, Cu, Co, Ni, Mn) или их комплексы. Кроме свободнорадикальных состояний методом ЭПР исследуют триплетные состояния, возникающие в ходе фотобиологических процессов.
Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт сравнительно недавно - в 1944 г. в Казанском Университете Евгением Константиновичем ЗАВОЙСКИМ при исследовании поглощения электромагнитной энергии парамагнитными солями металлов. Он заметил, что монокристалл CuCl2, помещенный в постоянное магнитное поле 40 Гаусс (4 мТл) начинает поглощать микроволновое излучение с частотой около 133 Мгц. Пионерами применения ЭПР в биологических исследованиях в СССР были Л.А. Блюменфельд и А.Э. Калмансон, которые опубликовали в 1958 г. в журнале Биофизика статью об изучении свободных радикалов, полученных под действием ионизирующего излучения на белки.
История открытия метода ЭПР
В 1954 г. Коммонеp, Таунсенд и Пэйк обнаpужили сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) свободных pадикалов в печени и дpугих тканях животных и в дрожжевых клетках
Метод ЭПР
Позволяет избирательно детектировать и изучать электронное строение различных парамагнитных частиц.
Современные спектрометры позволяют изучать парамагнитные молекулы непосредственно в процессе функционирования нативных биологических систем.
Можно изучать даже небольших животных помещенных в специально сконструированный резонатор спектрометра.
Позволяет обнаруживать неспаренные электроны при низкой их концентрации (10-5 М) в любом веществе, не разрушая и не видоизменяя его.
Парамагнетизм
Парамагнетики – вещества, молекулы которых обладают отличными от нуля магнитными моментами.
O2, NO, щелочные металлы, различные соли редкоземельных элементов и элементов группы железа.
Орбитальные механический и магнитный моменты электрона
Орбитальный момент количества движения электрона Р по орбите радиуса R равен (1) где m- масса электрона, v - его скорость
Орбитальному механическому моменту соответствует орбитальный магнитный момент (2) где I - сила тока в контуре, а S - площадь контура
Орбитальные механический и магнитный моменты электрона
S = πR2
где e - заряд электрона
Орбитальные механический и магнитный моменты
С другой стороны, из атомной физики известно, что орбитальный механический момент выражается через орбитальное квантовое число следующим образом (3)
n - орбитальное квантовое число, принимающее значения 0, 1, 2 и т.д
Тогда магнитный орбитальный момент будет выглядеть
(4)
Магнетон Бора
Для n=1 величина μ называется магнетоном Бора и является единичным магнитным моментом. Эта величина равна 9,27*10-21 Дж/м*Тл
(5)
Спиновые механический и магнитный моменты
Спиновый магнитный момент электрона связан со спиновым движением электрона, которое можно представить, как движение вокруг собственной оси. Спиновый механический момент электрона равен где S - спиновое квантовое число равное ½
Магнитный и механический спиновые моменты связаны соотношением где MS - магнитное квантовое число равное +1/2
Гиромагнитное отношение (γ)
Отношение магнитного момента к механическому называется гиромагнитным отношением (g) Для орбитального Для спинового
g - фактор
Для гиромагнитного отношения электронов, имеющих различный вклад орбитального и спинового движения, вводят коэффициент пропорциональности g, такой, что
Этот коэффициент пропорциональности называется g-фактором. когда отсутствует спиновое движение электрона и существует только орбитальное g=1 (S=0) если отсутствует орбитальное движение и существует только спиновое (например, для свободного электрона) g=2 (L=0)
Формула Ланде
Если свободный атом содержит несколько электронов, то их орбитальные и спиновые моменты складываются
В этом случае магнитные свойства атома будут определяться значениями квантовых чисел L (суммарный орбитальный момент) и S (суммарный спиновый момент), а также полным квантовым числом J.
При отсутствии суммарного спинового момента (S=0) g=1; При отсутствии суммарного орбитального момента (L=0) g=2 1 < g < 2
В большинстве случаев орбитальный магнитный момент равен нулю (L=0) поэтому при обсуждении принципа метода ЭПР рассматривается только спиновый магнитный момент
По законам квантования разрешены только такие квантовые состояния, для которых квантовые числа различаются на единицу. Для одиночных неспаренных электронов эти два состояния (+1/2 и -1/2) являются единственными возможными
По законам квантования разрешены только такие квантовые состояния, для которых квантовые числа различаются на единицу. Для одиночных неспаренных электронов эти два состояния (+1/2 и -1/2) являются единственными возможными
Расщепление энергетических уровней одиночных электронов в магнитном поле (эффект Зеемана).
Расщепление энергетических уровней в магнитном поле было обнаружено в 1896 году голландским физиком П. Зееманом эффект Зеемана лежит в основе явления ЭПР
Длина волны – Напряженность поля 3,2 см – 3000-4000 Э 8 мм – до 13000 Э
Индукция магнитного поля лежит в диапазоне (0,34-1,25 Т)
9,5 ГГц (X-полоса) ведется с растворами и при изучении систем, не требующих очень высокого разрешения спектров
25ГГц (K-полоса)
35 ГГц (Q-полоса)
Основное уравнение резонанса
Количество электронов, имеющих ту или иную энергию, будет определяться в соответствии с распределением Больцмана, а именно где n1 и n2 количество электронов на более высоком или более низком энергетическом уровне, соответствующем магнитному моменту электрона со спином +1/2 или -1/2
Основное уравнение резонанса
Если теперь на систему электронов, находящуюся в магнитном поле, подать электромагнитную энергию, то при определенных значениях величины энергии падающего кванта будут происходить переходы электронов между уровнями
Основное уравнение резонанса
Необходимым условием переходов является равенство энергии падающего кванта (hn) разности энергий между уровнями электронов с различными спинами (gbH). Уравнение выражает основное условие поглощения энергии электронами
энергетические уровни электронов, помещенных в магнитное поле, расщепляются в этом поле в зависимости от величины спинового магнитного момента и интенсивности магнитного поля
Квантомеханическая интерпретация ЭПР
В идеализированном случае (система изолированных парамагнитных центров) согласно распределению Больцмана нижние энергетические уровни N1 населены больше N2. поэтому электромагнитное излучение будет индуцировать переходы снизу вверх (поглощение), чем переходы сверху вниз (излучение). В целом будет наблюдаться поглощение энергии электромагнитного поля парамагнитным образцом.
«Индуцированная эмиссия»
Под действием излучения не только электроны, находящиеся на нижнем уровне, поглощают энергию и переходят на верхний уровень, но и электроны, находящиеся на верхнем уровне, переходят на нижний уровень и при этом излучают квант электромагнитной энергией
Переменное ЭМ поле с одинаковой вероятностью может индуцировать переходы как снизу вверх, так и сверху вниз. Такие индуцированные переходы сопровождаются изменением ориентации спина
Квантомеханическая интерпретация ЭПР
Как объяснить, что по мере поглощения энергии ЭМ поля образцом различие в заселенности энергетических уровней в теории будет исчезать после того как N1=N2 число поглощаемых квантов станет равным числу испускаемых следовательно в целом поглощения энергии ЭМИ не должно наблюдаться а в действительности дело обстоит иначе?
Явление магнитной релаксации
Парамагнитные частицы могут обмениваться энергией друг с другом и взаимодействовать с окружающими их атомами и молекулами. (в кристаллах спины передают свою энергию кристаллической решетке) благодаря быстрой безызлучательной релаксации спинов в системе успевают восстановиться практическое равновесное отношение заселенности зееменовских подуровней N2/N1 < 1
Модуляционный метод измерения
Основан на использовании колеблющегося магнитного поля, многократно проходящего через точку резонанса (пояснения на доске)
Метод накопления
Характеристики спектров ЭПР амплитуда сигнала
Сигнал ЭПР представляет собой первую производную от линии. Площадь под линией поглощения пропорциональна концентрации парамагнитных частиц в образце (пропорциональна второму интегралу от спектра ЭПР) Если два сигнала имеют одинаковую ширину, то концентрации парамагнитных центров соотносятся как амплитуды сигналов линии поглощения
Характеристики спектров ЭПР амплитуда сигнала
Для определения концентрации измеряют площади под кривой поглощения у эталона с известной концентрацией парамагнитных центров у измеряемого образца и неизвестную концентрацию; находят из пропорции, при условии, что оба образца имеют одинаковую форму и объем
Характеристики спектров ЭПР форма линии
Спектр ЭПР является не линейчатым, а непрерывным в некоторой окрестности точки резонанса. Функция, описывающая сигнал ЭПР называется функцией формы линии (в разбавленных растворах кривая поглощения описывается функцией Лоренца )
Характеристики спектров ЭПР ширина линии
Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) и электронов
Механизм релаксации заключается в передаче кванта электромагнитной энергии решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на низкоэнергетический уровень
Позволяет судить о реальных взаимодействиях, которые испытывает неспаренный электрон и которые приводят к неизбежному «размазыванию» его энергии.
Характеристики спектров ЭПР ширина линии
Величина Т1 называется временем спин-решеточной релаксации (взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с решеткой ) и характеризует среднее время жизни спинового состояния
Величина Т2 называется временем спин-спиновой релаксации (взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с магнитными моментами других электронов) Это взаимодействие приводит к уменьшению времени релаксации и тем самым к уширению линии спектра ЭПР
чем сильнее спин-спиновое и T2 и спин-решеточное T1 взаимодействие, тем шире спектральная линия.
Ширина одиночной линии ЭПР обратно пропорциональная параметрам T1 и T2.
Для свободных радикалов в растворе T1 >> T2 следовательно ширина линии будет определяться T2.
Характеристики спектров ЭПР механизмы уширения линии
Диполь-дипольные взаимодействия (взаимодействие магнитного момента неспаренного электрона с локальным магнитным полем, создаваемым соседними электронами и ядрами)
Анизотропия g-фактора орбитальное движение электрона создает переменнное магнитное поле с которым взаимодействует спиновый магнитный момент. Это взаимодействие приводит к отклонению g-фактора от значения 2,0023, соответствующего свободному электрону.
Динамическое уширении линии (взаимное превращение двух форм радикала)
Спиновый обмен (изменении направления спинового магнитного момента электрона на противоположное при соударении с другим неспаренным электроном или иным парамагнетиком )
Если спиновый и орбитальный моменты в атоме отличны от нуля, то за счет взаимодействия спинового и орбитального моментов энергетические уровни могут дополнительно расщепиться. В результате этого вид спектра ЭПР усложнится и вместо одной спектральной линии в спектре ЭПР появятся несколько линий.
Сверхтонкая структура спектров ЭПР
В основе расщепления линии ЭПР на несколько лежит явление сверхтонкого взаимодействия, т. е. взаимодействия магнитных моментов неспаренных электронов (MS) с магнитными моментами ядер (MN). В рассмотренном примере спин ядра, взаимодействующего с неспаренным электроном, полуцелочисленным дало расщепление на две линии. Такая величина спина характерна для протонов
Сверхтонкая структура спектров ЭПР
Позволяет многое узнать об энергии и локализации неспаренных электронов и о свойствах молекул вообще.
Если движение неспаренного электрона ограничено атомной орбиталью какого-либо одного атома, он будет взаимодействовать с ядром именно этого атома.
Необходимо помнить, что не все ядра обладают спином и магнитным моментом
Сверхтонкая структура спектров ЭПР
Вместо синглетной линии электронного поглощения возникнет (2I+1) линий равной интенсивности.
Полученная информация широко используется для определения значений ядерных спинов.
Имея спектры с эталонной сверхтонкой структурой, можно проводить качественный и количественный анализ спектров исследуемых веществ.
Сверхтонкая структура спектров ЭПР
Mn55 I=5/3 6 линий
Cu63 Cu65 I=3/2 4 линии
Для биохимика непосредственный интерес представляет фактическая величина расщепления между сверхтонкими компонентами и характер ее изменения с изменением угла.
Позволяет идентифицировать активный центр исследуемого соединения, установить природу химической связи, потенциальную активность различных групп, охватываемых орбиталью неспаренного электрона.
Метод спиновых зондов и меток
Формула спинового зонда ТЕМПО и его спектр ЭПР. В этом радикале неспаренный электрон локализован около ядра азота, магнитное поле которого накладывается на внешнее магнитное поле.
Пептид дельта сна
С использованием метода спиновых меток и зондов впервые выявлено наличие прямого взаимодействия пептида с клеточными мембранными структурами in vitro. Критерием динамического состояния липидных компонентов различных областей мембраны рассматривали параметр упорядоченности S, который характеризует молекулярную подвижность зонда и рассчитывается по спектрам ЭПР
Метод спиновых зондов и меток
Спиновые зонды. Время корреляции (время поворота нитроксильного радикала на угол 90оС) исследование мембран, рН внутри лизосом.
Спиновые метки. Количество и доступность SH-групп белков. Фермент-субстратные взаимодействия.
Метод спиновых ловушек. (нитроны и нитрозосоединения)
Сигналы ЭПР наблюдаемые в биологических системах
Спектр ЭПР печени крысы
Спектры ЭПР УФ-облученного цистеина
Сигналы ЭПР наблюдаемые в биологических системах
Применение метода ЭПР в биологических исследованиях связано с изучением двух основных видов парамагнитных центров - свободных радикалов и ионов металлов переменной валентности. Изучение свободных радикалов в биологических системах связано с трудностью, заключающейся в низкой концентрации свободных радикалов, образующихся при жизнедеятельности клеток. Концентрация радикалов в нормально метаболизирующих клетках составляет по разным источникам примерно 10-8 - 10-10 М, в то время как современные радиоспектрометры позволяют измерять концентрации радикалов 10-6 - 10-7 М
Повысить концентрацию свободных радикалов можно затормозив их гибель и повысив скорость их образования. Это можно сделать путем облучения (УФ или ионизирующей радиацией) биологических объектов находящихся при низкой температуре
Устройство радиоспектрометра ЭПР
Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн. Диафрагме спектрофотометра в радиоспектрометре соответствует аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектромере находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой параллелепипед, имеющий цилиндрическую или прямоугольную полость в которой находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что в нем образуется стоячая волна. Элементом отсутствующем в оптическом спектрометре является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов
Источником излучения в радиоспектрометре является клистрон, представляющий из себя радиолампу, дающую монохроматическое излучение в диапазоне сантиметровых волн. Диафрагме спектрофотометра в радиоспектрометре соответствует аттенюатор, позволяющий дозировать мощность, падающую на образец. Кювета с образцом в радиоспектромере находится в специальном блоке, называемом резонатором. Резонатор представляет собой параллелепипед, имеющий цилиндрическую или прямоугольную полость в которой находится поглощающий образец. Размеры резонатора таковы, что в нем образуется стоячая волна. Элементом отсутствующем в оптическом спектрометре является электромагнит, создающий постоянное магнитное поле, необходимое для расщепления энергетических уровней электронов
