Лабораторные методы диагностики беременности

1. Определение уровня прогестерона в крови или молоке коров на 21-24-е сутки после осеменения. Метод основан на том, что при отсутствии беременности к указанному сроку содержание прогестерона снижается в связи с рассасыванием желтых тел, тогда как у беременных остается относительно высоким.

Содержание прогестерона можно определить быстрым методом, для чего используют тестовые трубочки. В нее вносят 3 капли молока; при высоком уровне прогестерона получают яркое голубое окрашивание.

В условиях специализированной лаборатории уровень гормона определяют радиоизотопным методом. Положительный диагноз ставят при содержании прогестерона 11 ng/мл, отрицательный— 2 ng/мл и ниже. Точность отрицательных диагнозов составляет 96-97%, положительных – 75-82%. Диагностические ошибки возникают из-за увеличения продолжительности или выпадения половых циклов, персистенции желтого тела, резорбции зародыша.

2. Индукция течки у коров инъекцией малых доз эстрогенов (3-5 мг стильбестрола или комбинации стильбестрола с тестостероном) на17-24-е или 38-42-е сутки после осеменения. При отсутствии стельности в течение 5 суток после инъекции препарата проявляется стадия возбуждения полового цикла, тогда как стельные коровы на такую дозу препарата не реагируют.

Иммунологические методы. К настоящему времени определилось два подхода: 1 — определение наличия эмбриоантител в организме самки реакцией агглютинации; 2 — обнаружение иммунодепрессоров, которые циркулируют в крови беременной самки; они образуются в зародыше и подавляют материнский иммунный ответ. Иммунодепрессорный фактор (ранний фактор беременности) обнаруживается в материнской крови с 15-х по 38-е сутки после осеменения.

Иммунологические исследования – экспресс-тесты

Экспресс-тест «IDEXXVISUALPREGNANCYTEST» (США)

Реагенты: планшеты с адсорбированными Анти-PAG-антителами, положительный и отрицательный контроли, детектор-раствор, конъюгат, TMB-субстрат, стоп-раствор.

Материалы: дистиллированная/деионизированная вода, дозатор 0,1 мл (100 мкл), крышка для микропланшета, флакон-промыватель, адсорбирующий материал, использовали полотенце. Все реагенты перед использованием должны быть доведены до 18-26°C. Реагенты должны быть перемешаны осторожным переворачиванием и вращением (рисунок 6).

Рисунок 6. Тест-набор «IDEXX VISUAL PREGNANCY TEST»

Рисунок 7. Взятие крови у коров из хвостовой вены для исследований на стельность

Процедура тестирования:

- приготовить планшеты и записать расположение отрицательного и положительного контролей и тестируемых проб. При частичном использовании микропланшета, удалить из него лишние стрипы и оставить только необходимое их количество. Поместить не используемые стрипы вместе с влагопоглотителем в прилагаемый пакет с ZIP застежкой и поместить его назад в холодильник с температурой 2-8° C.

- внести 100 мкл (один полный наконечник) отрицательного контроля в одну соответствующую лунку;

- внести 100 мкл положительного контроля в одну соответствующую лунку;

- используя точный дозатор внести по 100 мкл образцов в соответствующие лунки;

- внести по 3 капли Реагента 1 (детектирующий раствор) в каждую лунку;

- накрыть планшет крышкой и слегка постучать по нему 10 раз для лучшего смешивания реагентов. Включить таймер и инкубировать 7 минут при температуре 18-26° C;

- снять крышку и перевернуть планшет над резервуаром для жидких отходов для удаления содержащейся в лунках жидкости. Убедиться, что вся жидкость была удалена из лунок;

- промыть каждую лунку дистиллированной/деионизированной водой. Для того, что бы убедиться, что все лунки были промыты, обращая внимание на то, что вода заполняет и переполняет лунки. Перевернуть планшет и с силой вытряхнуть жидкое содержимое. Повторить процедуру 2 раза. Далее легким постукиванием планшета об абсорбирующий материал удалить остаточную жидкость;

- внести по 3 капли Реагента 2 (конъюгат) в каждую лунку;

- накрыть планшет крышкой и слегка постучать по нему 10 раз для лучшего смешивания реагентов. Включить таймер и инкубировать 7 минут при температуре 18-26°C;

- повторить шаги 7 и 8;

- внести по 3 капли Реагента 3 (TMB субстрат) в каждую лунку;

- накрыть планшет крышкой и слегка постучать по нему 10 раз для лучшего смешивания реагентов. Включить таймер и инкубировать 7 минут при температуре 18-26°C;

- внести по 3 капли Реагента 4 (стоп-раствор) в каждую лунку;

- слегка постучать по планшету 10 раз для лучшего смешивания реагентов;

- поместить планшет на белую подложку (например, картонный лист, прилагаемый к набору, или лист белой бумаги). Считать результаты визуально.

Интерпретация полученных результатов:

- статус стельности каждого животного устанавливается путем визуального сравнения цветового окрашивания в лунке с пробой с лункой с отрицательным контролем.

- если цветовое окрашивание в лунке с исследуемым образцом менее или такое же как, как и в лунке с отрицательным контролем, исследуемое животное считается не стельным (не покрытым).

- если в лунке с исследуемым образцом имеется голубое окрашивание, более интенсивное, чем в лунке с отрицательным контролем, следовательно в сыворотке крови присутствуют гликопротеины PAG и животное считается стельным.

- результат в лунках с пробами, который трудно интерпретировать визуально, считается сомнительным, в этом случае животное необходимо проверить еще раз.

Для того чтобы тест был действительным необходимо, чтобы положительный контроль окрасился в синий цвет. Если положительный контроль не окрасился в синий цвет, результаты исследования считаются недействительными.