Пцр. Полимеразды тізбекті реакция. Днқ клондау әдісі. Днқ секвенирлеу әдісі. Электрофоретикалық әдіс
ДНҚ фрагменттерін секвенирлеу әдістері
жүктеу/скачать 22,55 Mb.
|
Мейрманова А Биология ПЦР
- Бұл бет үшін навигация:
- ДНҚ фрагменттерін секвенирлеу
- А.Максам мен У.Гилберт
- Максам мен Гилберттің химиялық әдісі
| ДНҚ фрагменттерін секвенирлеу әдістері
Саусақ ізі және рестрикциялық ДНҚ фрагменттерін талдаудың басқа әдістері гендік инженерияда көптеген маңызды жаңалықтар ашты, бірақ 100-500 жұп нуклеотидтерден тұратын ДНҚ фрагменттерін секвенирлеу әдістерін жасау нағыз жетістік болды. ДНҚ тізбегін анықтаудың бірінші тікелей әдісін 1975 жылы Ф.Сэнгер ұсынған.Ол ДНҚ-полимераза ферментінің көмегімен ДНҚ ұзаруына негізделген. Бұл әдіс ұзындығы 5,4 кб болатын x174 фагының қысқа ДНҚ-сын жылдам реттілікке келтіру үшін қолданылды. Бірдей қуатты ДНҚ секвенирлеу әдісін 1977 жылы Гарвард университетінде А.Максам мен У.Гилберт жасаған. Оның көмегімен бір жылдан аз уақыт ішінде sv-40 вирусының (5,2 кб) және pBR322 плазмидасының (4,3 кб) ДНҚ тізбегін орнату мүмкін болды. Максам мен Гилберттің химиялық әдісі - ДНҚ-ның толық нуклеотидті реттілігін анықтау үшін көп мөлшерде бірдей ДНК-молекулалары қажет. - Әр тізбектің 5 немесе 3 ұшына радиоактивті белгі енгізеді. - ДНК-ны балқытып, біртізбекті ДНК бөлініп алынады. - Әр пробиркаға 1 немесе 2 белгілі азоттық негіздерді арнайы бұзылған химиялық реагент қосылады. - Нәтижесінде осы нуклеотид орналасқан жерде ДНК тізбегі бұзылады.Белгіленген ДНҚ препараты төрт бөлікке бөлінеді және олардың әрқайсысы төрт ДНҚ негізінің бірін арнайы бұзатын реагентпен өңделеді. Реакция жағдайлары әр ДНҚ молекуласында аздаған зақымданулар болатындай етіп таңдалады. Бұл зақымдалған молекулаларды пиперидинмен өңдегенде, бұзылған негіз болған ДНҚ-да үзіліс пайда болады. Нәтижесінде таңбаланған фрагменттердің жиынтығы алынады, олардың ұзындықтары жойылған негізден молекуланың соңына дейінгі қашықтықпен анықталады. Мысалы, егер Г қалдықтары таңбаланған ұшынан 2, 6, 11 және 16 нуклеотидтер қашықтықта орналасса, онда бұл ДНҚ тізбегін Г-ыдырататын реагенттермен өңдеу ұзындығы 2, 6, 11 және 16 нуклеотидтер болатын таңбаланған фрагменттердің түзілуі (бір уақытта ұзындығы 3 және 4 нуклеотидтердің фрагменттері де табиғи түрде түзіледі, бірақ Г қалдықтарының арасында орналасқан бұл фрагменттер таңбаланбайды.). Суретте Сэнгердің секвенирлеу әдісі бойынша адамның геніне алынған ДНК-ның полиакриламидтік гелінің радиоавтографиясы көрсетілген. Радиограммада келтірілген ДНҚ-ның электрофоретикалық спектріне сүйене отырып, біз қарастырған әдіс бойынша бұл фрагменттің нуклеотидтер тізбегін анықтау оңай. Осылайша, маңызды адам генінің дәйекті ДНҚ фрагменті оның 50 нуклеотидінің келесі тізбегіне ие болады: ТАТЦАГАТЦТГЦААЦТЦАТАТГАТЦГАГАГГГАААТЦАТТЦТГТГААЦГ. Көбінесе митохондриялық ДНҚ талдау үшін де қолданылады. Ұрпаққа тек жұмыртқа арқылы берілетіні, яғни аналық жолмен берілетіні белгілі. Митохондриялық ДНҚ-ның нуклеотидтер тізбегін талдау бір дерлік детективтік оқиғада шындықты анықтауға мүмкіндік берді. Көптеген жылдар бойы көпшілік Анна Манехеннің өлімнен аман қалған орыс патшасы Николай II мен оның әйелі Александраның қызы Анастасия екеніне сенді. Төменде митохондриялық ДНҚ-ның нуклеотидтер тізбегінің фрагменті берілген (mtDNA) Анна Манехан. жүктеу/скачать 22,55 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|