ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

Перед культивированием материал больного (кроме крови и ликвора) центрифугируется (2000 оборотов в течение 10 мин). Берут надосадочную жидкость и обрабатывают антибиотиком широкого спектра действия (пенициллин) 500 тыс. ЕД на 1,0 мл. исследуемого материала для подавления бактериальной флоры.

Культура клеток – это клетки, которые способные жить в пробирках на искусственных питательных средах (среда 199).

Заражают 7-10 дневные куриные эмбрионы с учетом тропизма:

Культивирование проводят на мышах сосунках (до 2-х дней жизни), лабораторных крысах, морских свинках, кроликах. Заражают в зависимости от тропизма вируса:

• 
  Цветная проба.
  

• 
  Цитопатическое действие (ЦПД) - .
  

Виды ЦПД:

• 
  Реакция гемадсорбции. Берем культуру клеток, зараженных вирусом, и вносим эритроциты. После некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности клеток, пораженных гемагглютинирующим вирусом, остаются прилипшие эритроциты.
  

• 
  Гибель эмбриона
  
• 
  Отставание в развитии
  
• 
  Цитопатическое действие на оболочках эмбриона (некроз, кровоизлияния)
  
• 
  Гемагглютинация с жидкостями эмбриона.
  

• 
  Отставание животных в развитии
  
• 
  Развитие характерного симптомокомплекса заболевания.
  
• 
  Гибель животного (из органов готовят мазки-отпечатки и смотрят в них включения: ядерные и цитоплазматические).
  

По известной диагностической сыворотке определяем вид вируса в иммунной реакции.

• 
  Используются реакции преципитации в капилляре (при бешенстве). Основана на образовании видимого преципитата при взаимодействии антигена с иммунной сывороткой.
  
• 
  Прямая и непрямая реакция Кунса (грипп, аденовирусные инфекции). Используется для выявления микробных антигенов в тканях или патологическом материале. Метку антител производят флюорохромами (флюоресцеин или родамин). При образовании комплекса, антиген-антитело флюоресцирующий компонент вызывает свечение комплекса (желто-зеленое окрашивание), что облегчает учет результатов реакции микроскопически.
  

• 
  Воздушно-капельный (респираторные вирусы)
  
• 
  Фекально-оральный (Picornaviride, Reoviride, Caliciviride)
  
• 
  Передача при половых контактах (ВИЧ, ВПГ-2, гепатит В, ЦМВ)
  
• 
  Заражение через кожные покровы (герпес)
  
• 
  Инъекционная передача (ВИЧ, ЦМВ, гепатит А)
  
• 
  Вертикальная передача (трансплацентарная передача, перинатальное заражение и заражении при лактации – ВИЧ, ЦМВ, герпес, краснуха, гепатит В)
  
• 
  Трансмиссивная передача возбудителей зоонозных и арбовирусных инфекций (при укусе больного животного, через кровососущих членистоногих-переносчиков, при контакте с зараженным материалом).
  

• 
  Летние месяцы – период распространения многих энтеровирусов и инфекции переносимые кровососущими членистоногими (комары, клещи и др.)
  
• 
  Осенние месяцы - период распространения многих энтеровирусов, инфекции переносимые кровососущими членистоногими (комары, клещи и др.) и респираторные.
  
• 
  Зимние месяцы – приходится пик ОРВИ.
  

Полученную суспензию фильтруют и центрифугируют 10 минут при 1000 оборотов в минуту.

Надосадочная жидкость заменяется 2 мл питательной среды, осадок встряхивают до получения равномерной суспензии.

Определяют количество клеток в 1 мл суспензии при помощи камеры Горяева. Считают количество их в 1мл суспезии по формуле:

80
А – количество клеток в камере (считают в 5 больших квадратах по диагонали),

80 – количество малых квадратов,

1 мл – объем одного квадрата

1000

Для выделения аденовирусов производится одновременное заражение двух видов культур клеток: первично-трипсинизированную культуру фибробластов человека и перевиваемых Hep –2. Культуры тканей просматривают под малым увеличением микроскопа и отбирают пробирки с хорошим монослоем. Питательную среду сливают и заполняют средой 199 по 1 мл. Затем в каждую пробирку наливают по 0,2 мл вирусосодержащего материала. Исследование сопровождают контролем – пробирки с культурой клеток не зараженных вирусом. Пробирки помещают в термостат при 37⁰С на 48 часов.

• 
  Цветная проба - в пробирках с культурами клеток, зараженных вирусом (опытные пробирки), цвет индикатора питательной среды не меняется в результате размножения вируса и гибели клеток. При отсутствии вируса (контрольные пробирки) цвет питательной среды меняется с красного на желтый за счет ощелачивания продуктами метаболизма клеток.
  

Контрольная пробирка: .

Опытная пробирка: .

Цветная проба , что свидетельствует о _{(наличии, отсутствии)} вируса в материале обследуемого.

• 
  Выявление ЦПД вируса – нарушение целостности пласта клеток. Для выявления морфологических изменений в зараженных культурах клеток их просматривают под малым увеличением микроскопа, сравнивая с контрольными, незараженными вирусом культурами клеток.
  

Контрольная пробирка: .

Опытная пробирка: .

ЦПД .

• 
  Реакция гемадсорбции - в пробирки, с зараженной вирусом культурой клеток, без удаления питательной среды вносят по 0,2 мл 5% суспензии эритроцитов. Пробирки слегка встряхивают и оставляют на 15 мин при комнатной температуре, затем слой клеток 2 раза промывают физ.раствором. Учет результатов производится под малым увеличением микроскопа. При размножении в культуре клеток гемагглютинирующего вируса эритроциты адсорбируются на клетках и не отмываются от них при встряхивании.
  

Реакция гемадсорбции , что свидетельствует о _{(наличии, отсутствии)} у выделенного вируса гемагглютинина.

Смесь вирусосодержищего материала и диагностической противовирусной сыворотки по 0,2 мл. наливают в пробирку и ставят на 30 минут в термостат.

После микроскопии пробирок с культурами клеток под малым увеличением отбирают две пробирки с хорошим монослоем. Питательную среду сливают и производят её замену по 1 мл в каждую пробирку.

В опытную пробирку добавляют 0,2 мл смеси вируса и противовирусной сыворотки. В контрольную – наливают 0,2 мл вирусосодержащего материала. Обе пробирки помещают в термостат на 2-5 дней.

Результаты реакции оценивают по наличию или отсутствию ЦПД под малым увеличением микроскопа и изменению цвета индикатора среды 199. При соответствии вируса противовирусной сыворотке отмечается изменение цвета индикатора с красного на желтый и отсутствие ЦПД. При несоответствии вируса противовирусной сыворотке цвет индикатора не меняется и отмечается ясно выраженное ЦПД.

Учет результата:

Контрольная пробирка: цвет индикатора изменился , ЦПД .

Опытная пробирка: цвет индикатора изменился , ЦПД .

Реакция нейтрализации с сывороткой , что свидетельствует о _{(нейтрализации)} вируса.

1. 
   Приготовление первично-трипсинизированной культуры клеток
   
2. 
   Типы культур клеток
   
3. 
   Типы взаимодействия вируса с клеткой
   
4. 
   Этапы вирусологического метода диагностики
   
5. 
   Применение серологического метода и экспресс-диагностики.
   

1.Воробьев А.А. Медицинская и санитарная микробиологиялогия: учеб. пособиен для студентов мед вузов/. А.А.Воробьев и др. – 4-е изд., стер.- М.:Академия, 2010.-461 с: ил.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учеб. для мед. вузов / А.И.Коротяев и др.- 4-е изд., испр. И доп..- СПб.: СпецЛит, 2008. – 767 с.

3. Медицинская микробиология/ под ред. Поздеева O.K. - М.:ГЭОТАР Медиа, 2006. – 765 с.
Дополнительная литература

1. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии : учеб. для студентов мед. вузов / под ред. А.С.Быкова, А.А. Воробьева, В.В.Зверева - 2-е изд.- М. : «Миа», 2008. - 272 с.

2. Воробьев А.А., Кривошеин Ю.С., Широбоков В.П. Медицинская и санитарная микробиология: учебное пособие для студентов высших медицинских учебных заведении / А.А. Воробьев, Ю.С. Кривошеин, В.П. Широбоков – 2-е изд., М.: Академия, 2006.

3. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология: учебник для вузов -5-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2005.- 442с.

4.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Зверева В.В., Бойченко М.Н. Учебник в 2-х томах, М.: ГЭОТАР- Медиа, 2010.

5.«Определитель бактерий Берджи». Под ред. Хоулта Дж., Крича Н., Смита П. И др. В двух томах. М.: «Медицина», 1982.

7. Кузнецов Е.А. с соавт. Микробная флора полости рта и ее роль в

развитии патологических процессов. – М: «Медицина» -1996 г.

8. Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. – М: «Медицина». - 1991 г.

Перечень вопросов и заданий для самостоятельной работы:

По теме «Общая вирусология» в рабочей тетради заполнить разделы для самостоятельной работы: строение вирусов; форма вирусов; тип симметрии; тропизм; принципы классификации вирусов; типы и этапы взаимодействия вируса и клетки; культивирование вирусов; индикация и идентификация вирусов.

1. 
   Респираторные вирусы. Характеристика возбудителей ОРВИ (вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, риновирусы, ECHO, Коксаки, короновирусы, реовирусы). Лабораторная диагностика респираторных вирусных инфекций. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения респираторных вирусных инфекций.
   
2. 
   Энтеровирусы. Характеристика возбудителей кишечных вирусных инфекций (Коксаки А и В, ECHO, энтеровирусы, ротавирусы, аденовирусы). Лабораторная диагностика кишечных вирусных инфекций. Биопрепараты для диагностики, профилактики и лечения энтеровирусных инфекций.
   

Более 150 разновидностей вирусов вызывают ОРВИ. Вместе с вирусами гриппа они являются наиболее распространенными возбудителями, поражающими верхние дыхательные пути.

Возбудителями ОРВИ являются следующие представители :

РНК-содержащие вирусы