Сабақ 2-ші тақырып Гендік биотехнология негіздері
жүктеу/скачать 81,97 Kb.
|
Тәж 2
- Бұл бет үшін навигация:
- Тексеру сұрақтары
|
Тәжірибелік сабақ 2-ші тақырып Гендік биотехнология негіздері Мақсаты: Гендік инжинерия негіздері және әдістерімен танысу Жоспар: 1.Гендік инжинерия түсінігі мен әдістері 2. Гендік инженерия тарихы 3. Гендік инжинерия ферменттері Гендік инженерия дегеніміз, қарапайым сөзбен айтқанда, іп уііго жагдайында функционалды активті генетикалық құрылымдарды құрастыру, яғни рекомбинанттық ДНҚ жасау. Гендік инженерия - бұл нуклеин қышқылдары молекула- сымен клеткадан тыс реакциялар жүргізу арқылы генетикалық материалдың жаңа комбинациясын алу жэне жасалган гендердің конструкциясын тірі организмге енгізу, нэтижесінде бұл орга- низмде олардың активтігіне қол жетеді. Дәлірек айтқанда орга- низмнен тыс жагдайда алдын-ала жасалган жоба бойынша молекулалық генетикалық жүйелерді құрастырып, оларды одан кейін тірі организмге кіргізу болады. Рекомбинанттық ДНК мұндайда реципиенттік организмнің генетикалық аппаратының құрамдық бөлігі болып қалады. Ол ДНК организмге жаңа бірегей генетикалық, биохимиялық жэне физиологиялық қасиет береді. Қолданбалы гендік инженерияның мақсаты адам организмі үшін пайдалы қасиет беретін ДНК-нің рекомбинанттық молекула- ларын генетикалық аппаратқа кіргізу. Мысалы, адамзатқа керекті дэрілік заттарды өндіретін бмологиялық “реакторлар”- микроор- ганизмдер, осімдіктер, жануарларды жасау, белгілі багалы қасиеті бар өсімдік сорттарын жэне жануарлар тұқымын шыгару. Гендік инженерия әдістері тұқым қуалайтын ауруларды диагностика жүргізуге, вакциналарды дайындауга, эр түрлі сырқаттардың гено- терапиясын іске асыруга мүмкіндік береді. Рекомбинанттық ДНК технологиясы келесі эдістерді пайдаланады: -Рестрикциялайтын нуклеазалармен (рестриктазалар) ДНК-ні арнайы ыдырату. -ДНК-нің тазаланған фрагментінде барлық нуклеотидтерді тез секвенирлеу. Осы арқылы геннің шекарасын анықтайды. -Рекомбинанттық ДНК-ні құрастыру -Нуклейн қышқылдарын гибридизациялау нэтижееінде ДНК немесе РНК арнайы реттерін өте дэл анықтауға болады. Бұл эдіс нуклеин қышқылдарының комплементарлық қасиетіне негізделген -ДНК-ні клондау: ПТР көмегімен амплификациялау немесе бактериалдық клеткага кіргізілген ДНК фрагментін көбейту -Рекомбинанттық ДНК-ны клеткаларга немесе организмдерге кіргізу. Гендік инженерия тарихы Мұны шартты түрде үш кезеңге бөлуге болады. Бірінші кезенде іп уііго жагдайында ДНК-нің рекомбинанттық молекулаларын алуга болатыны дәлелденді. Алгашқыда эртүрлі плазмидалар арасында гибридтер жасалынды. Одан кейін бактериялардың эр түрлілері мен штаммдарының ДНК молеку- лаларын пайдаланып, рекомбинанттық молекулалар құрастыруга болатынына коз жетті. Олардың тұрақгылыгы, функцияланатыны байқалды. Екінші кезеңде прокариоттардың хромосомалық гендері мен эр түрлі плазмидалары арасында ДНК-ның рекомбинанттық молекулалары алынды. Олардың тұрақтылыгы мен өміршендігі дэлелденді. Үшінші кезеңде ДНК векторлық молекулаларына эукариот, ең алдымен жануарлар, гендері кіргізу жұмысы басталды. Гендік инженерияның нақты дүниеге келуін 1972 жылы деп есептейді. Рекомбинанттық ДНК-ні алгашқы рет Стенфордтық университетте П. Берг, С. Коэн, X. Бойер жасады. Олардың жасаган алгашқы рекомбинанттық ДНК-сін 8У40 вирусы, лямбда бактери- офагы жэне ішек таяқшасының галактоздық опероны құрады. 3. Гендік инженерия ферменттері Молекулалық биология, оның негізгі болімдері молекулалық генетика, генегикалық энзимология жэне нуклеин қышқылдары химиясының жетістіктері нэтижесінде гендік инженерияда қолда- нылатын ферменттер ашылып, олардың әсер ету механизмдері анықталды. Рекомбинантты ДНК-ні құрастыруда пайдаланылатын ферменттерді мынадай топқа бөлуге болады: -ДНК-ге комплементарлы ДНК тізбектерін синтездейтін ферменттер: ДНК полимераза -РНК-ге комплементарлы ДНК тізбектерін синтездейтін ферменттер: кері транскриптаза -ДНК тізбектердің синтезін бастайтын (инициаңиялайтын) ферменттер: праймаза -ДНК фрагменттерін қосатын ферменттер: ДНК-лигаза -ДНК фрагменттері ұштарының құрылысын өзгертуге мүмкіндік беретін ферменттер: терминалдық трансфераза, поли-А-полимераза -ДНК фрагменттерін түзуді катализдейтін ферменттер: рестриктазалар. ДНК-полимераза Ферментті 1955 жылы АҚШ галымы Корнберг ішек таяқшасының (Е.СоІі) клеткаларынан бөліп алып, оны ДНК-полимераза деп атады. (Қазіргі кезде ДНК-полимераза I дейді). Бір клеткада ферменттің 400 молекуласы табылды. Оның молекулалық салмағы 109000, бір полипептидті тізбек сфералық түрде болады. ДНК- полимераза бір тізбекті ДНК-нің репликациясын (қос тізбектің түзілуін) өте жақсы жүргізеді. Ал қос спиралді ДНК-де реплика- ция реакциясын жүргізбейді, ол үшін оны денатурациялау керек. Фермент ДНК-ні синтездеу үшін бастапқы тізбек (праймер) керек. Праймер құрамында көбінесе РНК-ге тэн нуклеотидтер 15-20 нуклеотид болады. Праймерді праймаза ферменті катализдейді. Праймер түзілген соң, ДНК-полимераза бір тізбекті ДНК-ні комплементарлық ережеге сэйкес қос тізбекті ДНК-ге айналды- рады. Ферменттің активтік орталыгында үш бөлім бар. Бір бөлімі субстраттарга арналган, екінші бөлімі бір тізбекті ДНК-ні үстап түрады, ал үшіншісіне праймер орналасады. 1-ші сурет. Матрицадагы (тізбектегі) аденинмен ТТФ комплементарлык катынаста тұр. Бастапкы тізбектегі 3'-ОН- ка келесі субстрат (мұнда ТТФ) косылады. Сондыктан тізбек 5'-3' багытымен өсіп түрады. Кері транскиптаза Кері транскрипция дегеніміз РНК молекуласында комплемен- тарлық ережеге сәйкес ДНК молекуласының синтезделуі. Кері транскрипция болатынын АҚШ галымы Темин болжаган еді. Темин қүстарда саркома деген ауруга шалдықтыратын вирустарга тэжірибе жасаган еді. Қүстарга ДНК синтезін тежейтін ингиби- торларды бергенде, олардың вирустық саркомамен ауырмайтынын байқаган. Вирустың геномы РНК болғандықтан, Темин тәжірибеге сүйене отырып, оларда ДНК синтезі болу керектігін тұжырымдады. Оган қоса актиномицин Д вирустың түзелуіне кедергі келтірген. Ал, ол кезде бұл антибиотиктің ДНК молекуласында РНК-нің синтезін тоқтататыны белгілі еді. Осындай деректерді негізге алып, Темин генетикалық информация РНК-ден ДНК-ге ауыса- тыны жөнінде гипотезаны жасады. Бірақ бұп гипотезаны дәлелдеу үшін ферментті табу керек болды. 1970 жылы Темин жэне онымен қатынасы жоқ Балтимор Раус саркомасының вирусынан іздеген ферментті тапты. Аталмыш РНК-ге тәуелді ДНК-полимеразаны кері транскриптаза деп атады (ТМД елдерінде ревертаза дейді, Реверс - кері деген магынада). Құстар ретровирустарының кері транскриптазасы толық зерт- телген. Әрбір вирионда бұл ферменттің 50 молекуласы болады. Кері транскриптаза екі суббірліктен тұрады: а (65 кД) жэне в (95 кД). Ферменттің үш түрлі катализдік активтігі бар. РНК жэне ДНК-ні матрица есебінде пайдаланатын ДНК- полимераздық активтік РНК-ДНК гибридінің құрамындагы РНК-ні гидролиздейтін рибонуклеаза Н (РНКаза Н) активтік ДНК-эндонуклеаздық активтік Вирустық ДНК-ні синтездеу үшін алдыңгы екі активтік керек, ал үшінші ягни эндонуклеаза клетка иесінің геномына вирустық ДНК интеграциялау үшін қажет болуы мүмкін. Тазаланган кері транскриптаза ДНК-ні РНК немесе ДНК-матрицада синтездей алады. Басқа полимеразалар сияқты синтезді бастау үшін кері транскриптазага праймер керек. Праймер есебінде РНК немесе ДНК-нің бір тізбекті сегменті пайдаланылады. 2-ші сурет. РНК молекулалары негізінде кос тізбекті ДНК сннтезінің үлгісі Гендік инженерияда кері транскриптазаны м-РНК-ні транс- крипциялап, кДНК (комплементарлы ДНК) түзеу үшін пайда- ланылады. Қажетті РНК-молекулаларының толық көлемді ДНК көшірмесін алу үшін арнайы тандалған жағдайларда РНК-аза активтігінің күшті ингибиторларын қолданып, кері транскрип- ция реакциясын жүргізеді. Кері транскриптаза үшін поли- (А) бар мРНК-да олиго-Т праймерлік рөл атқарды. Ал, 3’-поли (А) үштары жоқ РНКмолекулалары үшін поли (А)полимераза көммегімен бір тізбекті РНК-ге поли (А) молекулаларын қосады. Поли (Т) -праймерін пайдаланбауга да болады. Мүндайда поли (А) жоқ РНК-ның З-ОН жағына комплементарлы олигонуклеотидтерді химиялық жолмен синтездеп қосады. Бір тізбекті ДНК синтезі мен РНК-ні ажыратқан соң (әдетте сілтімен эсер етеді) ДНК-нің екінші тізбегінің синтезін жүзеге асырады. Мүндайда бір тізбекті ДНК- нің 3- ОН ұштарының ілмектері өзініің ДНК-сіне комплементарлы болғандықтан, олар праймерлер секілді рөл атқара алады. ДНК-нің бірінші тізбегі матрица рөлін атқарады. Бүл раекцияны кері транс- криптаза да, Е.СоІі-дің ДНК-полимеразасы да катализдей алады.Синтез аяқталганда ДНК-нің бірінші жэне екінші тізбектері прай- мер қызметін атқарған ілмекпен ковалентті байланысып қалады. Оны эндонуклеаза 81 ферменті көмегімен ыдыратады. Алынған кДНК-ні клондайтын векторларға кіргізеді, ДНК-нің гибридтық молекулаларында көбейтіліп, эрі қарай зерттеу жұмыстарында пайдаланылады. ДНК-лигаза 1961 жыл Мезельсон мен Вейгл фагта бөлінген ДНК моле- кулалары қайтадан қосылатынын байқаган. Осыдан кейін ДНК фрагменттерін тігуге қатысатын ферментті іздей бастаған. Ол ферментті 1967 жылы тауып, оны ДНК-лигаза деп атады. Фермент ДНК тізбектерінің ұшын немесе бөлшектердің арасын жалғас- тырады. Ол ДНК-дегі дезоксирибозалар арасын байланыстырып, қатар тұрған нуклеотидтерді тігеді. ДНК-лигаза ДНК-нің реплика- ңиясында, рекомбинация, репарациясында өте қажетті. Гендік инженерияда ДНК-лигазаның екі түрі қолданылады. Олардың кофакторлары эртүрлі жэне эсер ету механизмінде айыр- машылыгы бар. Е.соіі-дің ДНК-лигазасы дифоспиридиннукле- отидті керек етеді. Фаг Т4-дың ДНК-лигазасы М§2+-дың қаты- суымен АТФ молекуласы арқасында реакцияны катализдейді. Фаг Т4 лигазасы жабысқақ ұштарды тігумен қатар тұйық ұшты ДНК- нің екі тізбектік фрагменттерін қосу реакциясын катализдейді. Осы екінші түрді биотехнологияда жиі пайдаланады. Терминалдъщ трансфераза Терминалдық трансфераза (ұштық дезоксинуклетидтрансфе- раза) 1962 жылы Боллум бұзау тимусынан тапқан. Терминалдық трансферазаның субстратына 3'-ОН пен аяқта- латын бір тізбекті ДНК немесе 3'-ОН жағынан бір тізбегі шығыңқы қос тізбекті ДНК жатады. Бұның коферменті М§2+ болады. Егер кофактор есебінде Со2+ қолданылса, бұл фермент тұйық ұштарлы қос тізбекті ДНК-нің 3'-ОН жағына нуклеотидтерді қосу реакциясын катализдей алады. 1972 жылы терминалдық трансфераза көмегімен іп уііго ДНК молекулаларын рекомбинациялаудың алгашқы тэжірибесі жүзеге асты. 3-ші сурет. Рекомбинанттык ДНҚ Рестриктазалар Гендік инженерияда қолданылатын негізгі ферменттер рес- триктазалар болады. Прокариодтық клеткалар бөтен ДНК-ні қабылдамай, оны қайшы секілді қиып тастайды. Ол процесті рестрикция деп атайды. Ондай реакцияны катализдейтін фермент- терді рестрикцияның эндонуклеазалары немесе рестриктазалар деп атайды. Бүл ферменттер ДНК молекуласында нуклеотидтердің белгілі реттерін танып, үзеді (рестрикция сайттары). 1953 жылы анықталғандай Е.соіі белгілі штамының ДНК- сін басқа штаммның клеткасына енгізгенде генетикалық активтігін көрсетпейді, өйткені онда ұсақ фрагменттерге тез ыдырайды. 1966 жылы бұл құбылыстың табиғаты анықталды: клетканың өз ДНК-сі арнайы модификаңияға ұшырайды, дәлірек айтқанда, бірнеше нуклеотидтер метилденеді, ал бұл сырттан енгізілген ботен ДНК-де ондай метилденген нуклеотидтер жоқ болуы мүмкін. Әдетте метилдену, ягни метилдік топтың (СН3) нуклеотидтерге қосылуы репликаңия аяқталганда болады. Сонымен, бактерия өзінің ДНК-сін кез келген кіріп кеткен “бөтен” молекуладан айыра алу қабілеті модификаңия типіне байланысты. Модификаңияның метилдейтін ферменттерін ДНК-метилазалар деп атайды. Рестрик- ңиялайтын ферменттер тиісті сайттарда метилдік топтар жоқ болса, бөтен ДНК-ні қиып тастайды. Бактерияларда рестрикңия мен модификаңия жүйелері кең таралған, олардың болуы резиденттік ДНК-ні бөтен текті реттер- ден ластанудан маңызды қорганыстық рөл атқарады. 1970 жылы Смит басшылығымен Наеторһііиз іпйиепхае - дан алғашқы рестриктаза бөлінді, ол ДНК-нің тек белгілі ретін қиды (Ніпсі III). Әртүрлі бактериялар озінің ДНК-сін эр жолмен таңбалайтын болғандықтан, рестриктазалар да эртүрлі реттерді тануы тиіс. Бактериялардың барлық рестрикңиялық эндонуклеазалары (рестриктазалары) ДНК-нің арнайы, әжептеуір қысқа реттерін танып, олармен байланысады. Бұл үрдіс ДНК-молекуласының танылатын сайтында немесе басқа жерде қиылуымен қабаттасады. Бұл ферменттің типіне байланысты. Рестриктазаларды 3 негізгі класқа бөледі. Барлық рестриктазалар қос спиральді ДНК-да тек белгілі реттерді таниды. 1-типтегі рестриктазалар сайттан мыңдаған жердегі нуклеотидтер ретін қияды. 3-типтегі рестриктазалар ДНК-нің ферментпен байланыса- тын сайтынан 20-35 нуклеотид тұрған жерін үзеді. 2-типтегі рестрикциялардың байланысатыи сайтты мен қиятын нуклеотидтері бір жерде орналасқан. жэне 3 типтегі ферменттер күрделі суббірлікті құрылымға ие, олардың активтігі АТФ-ке тәуелді. 2 типті ферменттер 2 бөлек белоктардан тұрады: рестрикцияның эндонуклеазасы мен моди- фикациялайтын метилазадан. Гендік инженерияда тек 2 типтегі ферменттерді пайдаланады. Олар үшін кофактор есебінде магний иондары қажет. Қазіргі кезде 2 типті 500 рестриктазалар белгілі, олардың ішінде 200-дейі гендік инженерияда қолданылады. Әртүрлі микро- организмдерден бөлінген кейбір ферменттердің сайттары бірдей болып шықты. Ондай ферменттерді изошизомералар деп атайды. 2-типтегі рестриктазалардың көбісі 4-тен 6-ға дейінгі жұп нуклео- тидтерден тұратын реттерді таниды, сондықтан рестриктазаларды қысқа жэне ірілеп қиюшылар деп бөледі. Қысқа қиюшы рестрик- тазалар тетрануклеотидті танып, ДНК молекуласында көп фраг- менттер түзейді. Ал, ірілеп қиюшылар алты нуклеотидтық жұптар ретін таниды. Алты нуклеотидті жұп нуклеотидтерге қарағанда төрт нуклеотидтен тұратын реттер жиірек кездеседі. Қысқа қиятын рестриктазаларға НРаІІ мен Аіи (АіГһгоЬасІег Іиіеиз), ал ірілеп қиятындарға ЕсоШ (Е.соіі-ден) мен Ніпсі III жатады. Жорамал бойынша ДНК- молекуласы бойында рестрик тазалар нысаны - төрт нуклеотидтен тұратынын реттер эрбір 250 жұп негіз сайын 1 рет кездесуі тиіс, ал алты нуклеотидтер- ден тұратын реттер фермент үшін 4096 жұп сайын болуы мүмкін, яғни айырмашылығы 16-ға тең. Егер рестрикция сайты ген ішінде болса, онда ДНК-рестриктаза ол геннің инактивациясын туды- рады. Мұндай жағдайдың мүмкіндігі қысқа қиюшы рестриктазалар әсерімен жиі де, ондай оқиға ірілеп қиюшы эндонуклеазалар үшін өте сирек. Сондықтан генді бүлдіріп алмас үшін мамандар нуклеотидтық сайттық рестриктазаларды жиі қолданады. 1973 жылы Смит пен Натанс рестриктазалар номенклатурасын ұсынды. Рестрикциясы бар микроорганизмнің бинарлық аты бой- ынша эрбір ферментке ат қояды. Тұқым атының бірінше эрібіне түрдің алғашқы екі эрібін қосады. Езсһегісһіа соіі - Есо немесе Зігеріошусез аІЬиз - 8а1. Кейбір ферментке штамм белгісін қосады, мысалы ЕсоК. Бір бактериялық клетка кодтайтын рестрикцияның эртүрлі жүйелерін рим санымен белгілейді ЕсоК. 1... ЕсоК. V; Наеторһііиз іпйиепха клеткасынан: Ніпсі I, Ніпсі II, Ніші III. Сонымен рестриктазалар ДНК-нің қос спиралінің тек арнайы ретінде төрттен алтыға дейінгі негіздерден тұратын бөлігін қия алатынын айттық. Ол арнайы бөліктің ерекшелігі сол, оны ортадағы нүктеден 180° айналдырып керісінше оқыса да, мағынасы өзгермейді. Бұны екінші қатардағы симметриялық өсі деп сипат- тайды. Екінші сөзбен айтқанда оны палиндром деп атайды. Екінші ерекшелігі - клетканың өз ДНК-сіне рестриктаза тиіспейді, өйткені қиылатын сайт ферментпен метилденген. Сондықтан рестриктаза- лар тек метилденбеген бөтен ДНК-ні бөлшектейді. Рестрикциялық катализ кезінде ЕсоК. I Г мен А-ның арасын қияды. Г-А-А-Т-Т-Ц Ц-Т-Т-А-А-Г Л4 Г + А-А-Т-Т-Ц Ц-Т-Т-А-А Пайда болған бір тізбекті ұштарды “жабысқақ” ұштар дейді. Олар бір-біріне комплементарлы келеді. Егер Т-ның жанындағы А-да метил тобы (-СН3) болса, онда оған рестриктаза тиіспейді. .СН3 / ;Г-А-А-Т-Т-Ц Ц-Т-Т-А-А-Г — • ♦♦♦♦♦■ ♦♦ ♦ ♦♦♦♦ ■ ♦♦ тт !П Т-! А А Т4 ■■♦♦♦♦♦■♦ ♦ сн3 Нра I (Н. рагаіпйиепгае) ДНК-ні былай бөледі. т ^Г-Т-Т-А-А-Ц ••♦♦ ♦♦ ♦ ' ..♦♦♦♦♦ ■ ♦♦ —— Ц-А-А-.Т-Т-Г Г -Т-Т А-А-Ц тттттттг г. Ц -А-А Т-Т-Г Мұнда ДНК-нің бөлінген жері тұйықтанган. Гендік инженерияда қолданылатын рестриктазалардың сайты ДНК-нің эр жерінде жэне эр түрлі екендігі төмендегі кейбір ферменттердің тізімі көрсетеді.
Биотехнологияда рекомбинанттық ДНК түзеу үшін “жабысқақ” үштары бар фрагменттерді жиі қолданады, өйткені оларды қайтадан ДНК-лигаза қатысуымен қосуы ыңгайлы. Әдетте түйық үштары бар фрагменттерді “жабысқақ” үштарга айналдырады. Бірақ, “жабысқақ” үштар жасамай-ақ та оларды қосуга болады. Тексеру сұрақтары: Гендік инжинерия дегеніміз не? Ферменттерді аты мен қызметтері қандай? жүктеу/скачать 81,97 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|