Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений
жүктеу/скачать 54,5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- CTAB-буфера для ДНК экстракции
| Осаждение ДНК проводится равным объемом изопропилового спирта при комнатной темперетуре (см. прил.1). Процедуру осаждения ДНК необходимо проводить быстро, чтобы предотвратить осаждение полисахаридов и пигментов с осадком ДНК. Осадок ДНК необходимо тщательно промыть 70% этанолом, чтобы удалить остатки буфера для экстракции, изопропанола и хлороформа.
Протокол: 1. 100 мг свежих листьев или проростков растений (или материал, сохраненный в растворе RNAlater для хранения на основе сульфата аммония, см. прил.1) растереть в пробирке “Eppendorf” объемом 1,5 мл с 500 мкл CTAB-буфера для ДНК экстракции, добавить 1 мкл РНКазы А (10 мг/мл), перемешать на вортексе и инкубировать при 55–65°C в течение 30–60 мин. Дополнительно доинкубировать при 37°C в течение 10–15 мин., чтобы РНКаза А разрушила геномную РНК. 2. В пробирку добавить равный объем (500–600 мкл) смеси хлороформ: изоамиловый спирт (25:1), тщательно перемешать на вортексе (важно максимально отделить ДНК от белков) и центрифугировать при 14000 об/мин 5 мин (разделение органической и водной фаз). 3. Верхнюю водную фракцию перенести в чистую 1,5 мл пробирку, содержащую равный объем (600 мкл) холодного изопропанола (+4°C), и тщательно перемешать на вортексе (спирт осаждает ДНК из раствора при тщательном перемешивании). 4. ДНК осадить центрифугированием в течение 5 мин при 14000 об/мин; надосадочную жидкость осторожно слить. 5. Добавить в пробирку с осадком ДНК 1мл 70% этанола, на вортексе тщательно перемешать, чтобы осадок плавал в спирте. Повторить центрифугирование в течение 5 мин при 14000 об/мин; надосадочную жидкость аккуратно слить (осадок плохо удерживается на дне пробирки после промывки в 70% этаноле). 6. Осадок ДНК не сушить и сразу растворить в 200–500 мкл 1хТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 8.0 1mM ЭДТА) при 55°С, периодически перемешивая, 10–20 минут. Как правило, осадок ДНК сразу же всплывает на поверхность раствора 1хТЕ и растворяется. ДНК хранить при температуре -20°С (длительное хранение) или при +4°С (при частом использовании). 7. Концентрацию ДНК определить с помощью флюориметра VersaFluor Fluorimetry или с помощью кюветного спектрофотометра Smartspec Plus. С определением концентрации ДНК с помощью спектрофотометра NanoDrop® ND-1000 UV-Vis можно познакомиться по адресу:http://www.nanodrop.com. 8. Маточный раствор ДНК разбавить в новые микропробирки до концентрации 10 нг/мкл и хранить при 4°С. Маточный раствор ДНК хранить при -20°С. жүктеу/скачать 54,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|