Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений
Амплификация ДНК с произвольными праймерами
жүктеу/скачать 54,5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- Triton X-100
| Амплификация ДНК с произвольными праймерами
Инкубационную смесь готовить в стерильных условиях в боксе для ПЦР работ BioSan UV-Cleaner box-1200 или под ламинаром. Для составления реакционной смеси используют 0,6 мл пробирки “Eppendorf”. Реактивы: 1. Деионизированная вода “MilliQ”; 2. 10хбуфер для ПЦР, содержащий 25 мМ MgCl2, (прилагается к Taq-полимеразе фирмой-изготовителем); 3. Раствор 10 мМ dNTPs (дезоксинуклеотидтрифосфаты) (смесь 10 мМ каждого dATP, dGTP, dCTP, dTTP); 4. RAPD- праймеры; 5. Раствор Taq-полимеразы (5 ед. на мкл); 6. Минеральное масло (только для амплификации в «Терцике МС-2+ »); 7. Образец матричной ДНК (с концентрацией 10 нг/мкл); В состав ПЦР буфера (10х) входят следующие компоненты: 100 мM Трис-HCl (рН 9,0); 500 мM KCl; 1% тритон Х-100 и 25 мM MgCl2. Высокое значение рН необходимо из-за того, что при повышении температуры рН Tрис-буфера падает (температурный коэффициент ~ -0.031ед. рН/°C) и при 72°С составляет ~7.5. Оптимальная концентрация Taq-полимеразы – 1 единица фермента на 20 мкл реакционной смеси. Triton X-100 - предотвращает адсорбцию полимеразы на поверхности пробирки. Диапазон рабочих концентраций MgCl2 – от 1.5 до 5.0 мM. При увеличении концентрации Mg2+ увеличивается эффективность амплификации, но может снижаться специфичность реакции. Диапазон используемых концентраций dNTP’s – 100 – 500 мкM (200 мкM – оптимальная концентрация). Используемый диапазон концентраций RAPD-праймера для проведения ПЦР: 0.2–1.0 мкM. Протокол: 1. Подготовить смесь «Master-Mix». При постановке эксперимента необходимо сделать общую реакционную смесь для ПЦР («Мaster-mix»), содержащую все необходимы компоненты, кроме ДНК и праймера. Для этого необходимо рассчитать общий объем реакционной смеси для всех образцов плюс еще несколько образцов. Например, для амлификации 8 образцов по 25 мкл конечного объема, приготовить смесь для 10 образцов, что будет составлять 250 мкл (в последовательности от воды до Taq-полимеразы). 2. В стерильную и подписанную 0.5 мл пробирку для ПЦР внести 21 мкл смеси «Master-Mix»; 3. Необходимо заранее подготовить праймеры в концентрации 10 мкМ в растворе 1хТЕ. Это можно сделать вручную или найти в табл. 2: необходимый объем каждого праймера на одну реакцию находится в графе «Vpr=»; кроме того, в колонке «Tm» можно найти необходимую температуру отжига для данного праймера. 4. Добавить 1.5 мкл 10 мкМ RAPD-праймера в конечной концентрации 0.6 мкМ на пробу; 5. Добавить Tag-полимеразу из расчета 0.8 мкл (2 ед.акт.) на 1 реакцию; 6. Внести в пробирку образец ДНК 2.5 мкл (10нг/мкл), конечная концентрация ДНК в реакционной смеси составляет 1 нг/мкл; 7. При проведении амплификации в амплификаторе «Терцик МС2+» поверх реакционной смеси поместить 2 капли минерального масла, предохраняющего смесь от испарения при нагревании во время амплификации; 8. Смесь аккуратно перемешать на вортексе; 9. Сбросить содержимое на дно пробирок (центрифугирование 5 сек при 2400 об./мин); 10. Установить пробирки в блок амплификатора в симметричной ориентации, плотно закрыть крышку блока; 11. Запустить программу амплификации последовательностью команд: <пуск>, <блок № >, <программа № >, <25 мкл >. 12. После окончания амплификации выполнить команду <сброс>. При вводе количества праймеров на одну пробу и числа проб итоговые количества реактивов рассчитываются автоматически (все объемы указаны в мкл). Распечатанной таблицей можно пользоваться как документом, описывающим ход и результат реакции. Амплификацию провести в амплификаторе «Терцик» или «MJ MiniCycler» по следующей программе: 1. Предварительная денатурация – 94°C, 4 мин; 2. Тридцать пять циклов: 1) 95°С, 15 сек; 2) 37°С, 1 мин; 3) 70°С, 2 мин; 3. Конечная элонгация: 72°С, 5 мин. После окончания амплификации провести электрофорез ДНК в агарозном геле. жүктеу/скачать 54,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|