Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений
жүктеу/скачать 54,5 Kb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- CTAB Буфера
|
Выделение геномной ДНК из листьев древесных растений Процедура выделения ДНК широко используется и часто является исходным пунктом в большинстве генно-инженерных и молекулярно-генетических исследований. Предлагаемый метод выделения ДНК с помощью детергента CTAB является модификацией метода Murray и Thompson (1980) и может быть использован как для аналитического выделения при скрининге большого количества материала, так и для препаративного выделения геномной ДНК из растительного материала. Процедура выделения растительной ДНК состоит из нескольких стадий: лизис клеток, разрушение РНК, депротеинизация и экстракция ДНК с помощью органических веществ (хлороформ) и последнее осаждение нуклеиновых кислот с помощью этанола или изопрапанола (ДНК осаждается из раствора с помощью спирта при наличии высокой концентрации ионов натрия, или лития, или аммония). Для разрушения клеточных стенок листья растений тщательно растирают ошлифованным стеклянным пестиком в течение одной-двух минут в пробирке “Eppendorf” в присутствиии CTAB Буфера для ДНК экстракции (см. приложение 1). Трис, входящий в состав буфера, обеспечивает необходимый pH раствора (ДНК наиболее стабильна при рН от 7.0 до 8.5). ЭДТА используется в качестве хелатирующего агента для связывания ионов магния и кальция в растворе. В состав буфера экстракции входит CTAB – катионный детергент, который эффективно разрушает клеточные мембраны, и при высокой концентрации NaCl (1М) нуклеиновые кислоты растворяются, а белки и полисахариды осаждаются из раствора. После экстракции хлороформом комплекс СТАB с полисахаридами и белками оказывается в интерфазе и в органической фазе. Для осаждения белков и растворения комплекса ДНК-СТАB в буфер для экстракции добавляют 1.4М NaCl. Дополнительно в буфер для экстракции перед использованием добавляют РНКазу А. Удаление клеточной РНК необходимо при дальнейшем использовании образцов ПЦР. РНКазаА эффективно деградирует клеточную РНК при 37С, поэтому желательно доинкубировать образцы при 37С перед ДНК экстракцией с помощью хлороформа. Для экстракции ДНК из раствора используется смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1). Изоамиловый спирт уменьшает пенообразование и уменьшает окисление хлороформа при хранении. жүктеу/скачать 54,5 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|