Г. Б. Бекимова б-42. Ауыл шаруашылық өсімдіктерінің биотехнологиясы. / Пәннің оқу-әдістемелік жинағы. Көкшетау, 2015. 133 бет. «Ауыл шаруашылық -өсімдіктерінің биотехнологиясы»

• 
  өздік жұмыстың түрлі қалпын ұйымдастыру;
  
• 
  өздігінен материалды жаттау үшін оқытудың инновациялық тәсілдерін қолдану;
  

• 
  жоғары сапалы тұқымды алу технологиясынан білімін көрсету;
  
• 
  тұқымтану және ауылшаруашылық мәдениетінің селекция негіздерінен дағдылары болу;
  
• 
  ауылшарушылық мәдениетінің себу апробациясын өткізе алу;
  
• 
  тұқымның себу алқабының есебі және өнімділік көлемінің моделін құрастыра алу;
  
• 
  ауылшаруашылық мәдениеті тұқымдарын сақтаудың және өндеудің негізгі технологияларын қолдана алу;
  
• 
  түсіндірілген ауылшаруашылық мәдениеті, олардың биологиялық, сапалық және шаруашылық ерекшеліктерін, қоршаған ортаның жағдайына байланысты талаптары туралы білімдерін көрсету.
  

Инвитро органдарды, ткань, клетка және жоғары өсімдіктердің дараланған протопластарын, а/ш өсімдіктерінің ғылыми және өндіріс салаларының биотехнологиясы. Биотехнология ғылымының даму тарихы. Генетикалық әртүрлілерді жасаудағы клеткалық технология. Мәдени клетка және тканьдардың биологиясы. Клонды микро көбейу және өсімдіктерді емдеу. Өсімдіктердің өсіп-өнуінің реттеушілері. Киосақтау, клетка және тканьдардың банкілері.

2. 
   ӨБСӨЖ оқу-тақырыптық жоспары
   

ОБСӨЖ тақырыптары бойынша тапсырмалар: конспект жазу, реферат дайындап келу, баяндама жасау

1. 
   Биотехнология растений. Г.Ж. Валиханова, А.: Қонжық – 1996.
   
2. 
   Биотехнология зерновых культур. И.Р. Рахимбаев, Ш. Тивари, А.: Ғылым – 1992.
   
3. 
   Сельскохозяйственная биотехнология. Под ред. В.С. Шевелуха, М.: Высшая школа – 2003.
   
4. 
   Основы сельскохозяйственной биотехнологии. Г.С. Муромцев, Р.Г. Бутенко, М.: Агропромиздат – 1990.
   

1. 
   Егіс дақылдарының селекциясы. Т.Н. Нұрғалиев, Ә.Қ. Қойшыбаев, Алматы – 1993.
   
2. 
   Биотехнология в растениеводстве. В.И. Зотиков, М.А. Нетесова, Акмола – 1996.
   
3. 
   Основы генетической инженерии. Э.С. Пирузен, М.: Наука – 1988.
   
4. 
   Культура клеток и биотехнология растений. Г.Ж. Валиханова, И.Р. Рахимбаев, А.: КазГУ – 1989.
   

Объективтілігі (бағалау жүйесінің нақты эквиваленті). Айқындылығы (хабарландуы).

Ыңғайлылығы (әртүрлі бақылау формасын ескеру). Жоғары дифференциация (көп ұпай бағалу шкаласының көмегімен жоғары дифференциациялау). Студенттерге оқу әрекетінің әрбір түрінің бағалау ережесін және ағымдық аралық, қорытынды ұпайлардың критерийін уақытында айту (семестр басында, сабақ басында, бақылау жұмысының алдында). бағаны қою саясанты 100 ұпайлық (100 %) жүйеге негізделеді және ұпайлардың төмендегідей бөлуін қарайды.

"Өте жақсы" - 90-100% деген бағаны оқу-бағдарламалық материалдың жүйелік және терең білімін жан-жақты меңгеретін, сонымен қатар бағдарламамен ұсынылған барлық тапсырмаларды орындай білетін, негізгі және қосымша әдебиеттермен жақсы танысқан студентке қойылады.

"Жақсы" - 75-89% деген бағаны оқу-бағдарламалық материалдың жүйелік түрде білімін көрсете білген, сонымен қатар бағдарламамен ұсынылған барлық тапсырмаларды орындай білетін, негізгі әдебиеттермен жақсы танысқан студентке қойылады.

"Қанағаттанарлық" – 50-74% деген бағаны оқу-бағдарламалық материалдың негізгі білімін меңгере білген, сонымен қатар бағдарламамен ұсынылған тапсырмаларды қанағат түрде орындай білетін, негізгі әдебиеттермен танысқан студентке қойылады.

10. 
    ОҚУ ПӘНІНІҢ САЯСАТЫ ЖӘНЕ АКАДЕМИЯЛЫҚ ЭТИКА
    

• 
  Сабаққа кешікпей келу.
  
• 
  Дәрісте сөйлеспеу.
  
• 
  Сабақ кезінде ұялы телефон арқылы сөйлесуге болмайды.
  
• 
  Сабақтардан қалмау .
  
• 
  Оқыту үрдісіне белсенді қатысу.
  
• 
  СӨЖ, аралық және соңғы бақылау тақырыптары мен тапсырмаларын уақытында тапсыру. Бағаны қөтеру үшін тақырыптарды қайтадан тапсыруға рұқсат берілмейді.
  

- делеция - генетикалық материалдың бір бөлігінің жойылуы, бір нуклеотидтен бірнеше гендерге дейін.

- инверсия - хромосоманың құрылымының бұзылуы, хромосоманың бір бөлігінде гендер 180 град айналып, кері орналасуына байланысты хромосомалық мутация.

- дупликация - хромосоманың өзгеруі негізінде болатын геннің немесе хромосоманың бір бөлігінің екі еселенуі.

- транслокация - бір немесе бірнеше хромосомалардың гомологті емес бөліктерінің алмасуы.

- транспозиция - хромосома бөлігінің сол хромосома ішінде не басқа бір хромосомаға ауысуы немесе ығысуынан болатын мутация.

1. 
   Өсімдік жасушаларын өсірудің қысқаша тарихы.
   
2. 
   Биотехнологияның пән аралық байланыстары.
   
3. 
   Өсімдік жасушаларының тотипатенттілігі.
   
4. 
   Өсімдк жасушаларын қоректік ортада өсіру жолдары.
   

Өсімдіктер биотехнологиясы ғылым ретінде ботаниканың негізінде пайда болып алғашында биотехнологиялық процесстерді баяндау жолымен түсіндірілді. Физикалық-химиялық зерттеулердің әдістерінің пайда болуына байланысты бұл ғылым дамып, өсімдіктерде өтетін процестерді тәжірибе негізінде зерттейді. Өсімдіктер биотехнологиясының табыстары ең алдымен физика мен химия саласындағы жаңалықтарға байланысты болды. Бұл ғылымдардың жетістіктері биотехнологиялық процестерді молекулалық деңгейде зерттеп, білуге жәрдемдесетін әдістерді жасап шығаруға мүмкіндік берді. өйткені физиологиялық функциялар негізінде биохимиялық реакциялар жатады. Ауорганизмді құратын заттардың қасиеттері олардың физикалық құрылымына байланысты. Элементтік және молекулалық құрам организм құрылысына, құрылым функциясы атқаруына байланысты. Химия мен физиканың, биохимия мен биофизиканың енуі ғылымның жаңа салалары биотехнологияның пайда болуына мүмкіндік туғызды.

Тотипатенттілік деген –жасушаның өзіне тән генетикалық потенциялын толық жүзеге асыру қасиеті. Тотипатенттілік қасиет туралы гипотеза белгілі ғалым Г.Габерландтың есімімен байланысты.

Өсімдіктің жеке жасушасы жасанды ортада өздігінене дами алады. Мұндай тәжірибені алғашқы рет 1902 жылы Габерлант жүргізді, ал 1930 жылы Уайт оқшауланған тамырларды жасанды ортада өсіріп, олардың дамуын байқады. Осы әдіспен сәбіз тамырынан бөліп алған бөліктерді жасанды стирильді ортада жетілдіру арқылы каллус ұлпасы өсірілді. Каллус тек біріңғай паренхима жасушаларынан тұрады. Бұл факторлардың әсерімен каллус дифференциацияланып, одан әрі түрлі тканьдер пайда болады. Каллусты өсіру арқылы жасушалардың өсуіне, дамуына қажетті қоректік заттар, витаминдер мен гармондардың әсерлері зерттеледі.

Іn vitro жағдайында өсірілетін ұлпа –каллус. Каллус деп жасушалардың ретсіз бөлінуі салдарынан пайда болған диференцияланбаған жасушалардан тұратын ұлпаны айтады. Жасушаларды агары бар қатты немесе сұйық қоректік ортада өсіреді. Жеке жасушаларды немесе кішігірім жасушалар топтарын арнаулы апараттарды қолданып, олардың аэрациясы мен араластыруын қамтамасыз ете отырып сұйық ортада өсіруді жасушалық суспензия деп атайды.

Жасушалардан ферменттердің әсерімен протопластарды бөліп алу және оларды өсіру әдісі елеулі бір тарихи кезең болады. Себебі протопластарды өсіру өсімдктер биотехнологиясының жасушалық және гендік инженериясы деген маңызды бағыттардың негізін қалады. Биотехнология биологиялық процестер мен обьектілерді пайдалануға негізделген, экономикалық жағынан тиімді де маңызды заттарды өндіру және жоғары өнімділігі бар организмдерді шығаратын ғылыммен өндірістің жаңа бағыты. Өсімдік биотехнологиясы жалпы биотехнологияның күрделі бір саласы. Оның негізінде өсімдік жасушаларын жасанды қоректік ортада өсіру әдістері жатады.

1. 
   Жасушаларды өсіру дегенімізді қалай түсінесіз?
   
2. 
   Жасушалардың тотипатенттілігі деген не? Кім бірінші болып осы туралы ой қозғады?
   
3. 
   Каллус деген не? Регенерант өсімдік қайдан шығады?
   
4. 
   Жасушалық суспензия деп нені айтады?
   
5. 
   Өсімдіктер жасушаларын өсіру әдістерін дамытуға өз үлестерін қосқан ғалымдар кімдер?
   
6. 
   Биотехнология деген не?
   

Гендік инженерия ол функционалдық активті генетикалық құрылымдарды рекомбинаттық ДНҚ молекулалары түрінде қолдан құрастыру. Гендік иженерияның мәні жеке гендерді бір организмнен алып басқа организмге көшіру. Бұған рестриктаза мен лигаза ферменттерінің ашылуы мүмкіндік туғызады. Рестриктазалар ДНҚ молекуласын белгілі жерлерден жеке үзінділерге қиып бөлшектейтін ыдыратушы фермент. Қазір ДНҚ молекуласын бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзетін 500-ден астам рестриктазалар анықталған. Алынған полинуклеотид бөлшектерінінің комплементарлық немесе жабысқыш ұштарны ДНҚ лигазасы – бір-біріне желімдеп реттеп жалғасытырып қосады. Осы ферменттердің көмегімен бір ДНҚ молекуласынан қажетті ген бөлініп алынып, басқа ДНҚ молекуласын үзінділерімен құрастырылып рекомбинанттық, яғни жаңа будан ДНҚ жасалады.

1975 жылы биоқауіпсіздік туралы Халықаралық конференцияда (Асиломар, Колифорния) рекомбинантты ДНҚ молекуласы экспериментінің негізгі қағидасы қабылданды.

1985 жылы Биоқауіпсіздік ақпараттық жұмыс тобы құрылды, оған БҰҰ индустриалды даму Ұйымының елдер-мүшелері кірді, және қоршаған ортаны қорғау Бағдарламасы БҰҰ, сонымен қатар Бүкіл әлемдік денсаулық сақтау ұйымы.

1991 жылы оларға БҰҰ Тағамдық ресурстар мен ауылшаруашылық ұйымы қосылды.

Биотехнология аумағында заңнама жасау әлі толық жөнге келмеді.

Бір жағынан үкімет тарапынан биотехнологиялардың легализациясы болып жатса, екінші жағынан заңнамадағы өзгешеліктер өнімді глобаоды нарыққа шығаруға кедергі жасап отыр.

1.1. Гендік инженерия - молекулалық және жасушалық генетиканың қолданбалы саласы. Белгілі қасиеттері бар генетикалық материалдарды In vitro жағдайында алдын-ала құрастырып, оларды тірі жасушаға енгізіп, көбейтіп, зат алмасу процесін өзгеше жүргізу. Бұл әдіспен организмдердегі генетикалық информацияны көздеген мақсатқа сай өзгертіп, олардың геномдарын белгіленген жоспармен қайта құруға болады.

Гендік инженерия ол функционалдық активті генетикалық құрылымдарды рекомбинаттық ДНҚ молекулалары түрінде қолдан құрастыру. Гендік иженерияның мәні жеке гендерді бір организмнен алып басқа организмге көшіру. Бұған рестриктаза мен лигаза ферменттерінің ашылуы мүмкіндік туғызады. Рестриктазалар ДНҚ молекуласын белгілі жерлерден жеке үзінділерге қиып бөлшектейтін ыдыратушы фермент. Қазір ДНҚ молекуласын бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзетін 500-ден астам рестриктазалар анықталған. Алынған полинуклеотид бөлшектерінінің комплементарлық немесе жабысқыш ұштарны ДНҚ лигазасы – бір-біріне желімдеп реттеп жалғасытырып қосады. Осы ферменттердің көмегімен бір ДНҚ молекуласынан қажетті ген бөлініп алынып, басқа ДНҚ молекуласын үзінділерімен құрастырылып рекомбинанттық, яғни жаңа будан ДНҚ жасалады.

Одан кейін рекомбинанттық ДНҚ бірнеше әдістермен тірі жасушаға енгізіледі. Жаңа геннің экспрессиясы өтеді де жасуша сол ген белгілейтін белокты синтездей бастайды. Сонымен, жасушаға рекомбинанттық ДНҚ молекуласы түрінде жаңа генетикалық информация енгізіп, ақырында жаңа белгісі жаңа белгісі бар организмді алуға болады. Бұндай организмді трансгендік немесе трансформацияланған организм деп атайды, себебі организмдер өзгеріп басқа қасиетке ие болуын трансформация дейді.

Сөйтіп, гендік инженерияның дамуына негіз болған молекулалық биология мен молекулалық генетиканың мынадай жетістіктер:

1. 
   рестректазалармен лигазалардың ашылуы;
   
2. 
   генді химиялық және ферменттерді қолдану арқылы синтездеу әдісі ;
   
3. 
   бөтен генді жасушаға тасымалдаушы векторларды пайдалану;
   
4. 
   бөтен генге ие болған жасушаларды таңдап бөліп алу жолдарының ашылуы.
   

Өсімдіктердің гендік инженериясы саласында бірінші жұмыстар In vitro өсірілетін жасушалармен 1980 жылы жүргізілген 1983 жылы алдымен күнбағыстың трансгендік каллусы, кейін сол каллустан табиғатта мүлдем болмаған санбин өсімдігі алынды.

Санбин деген ол геномында бұршақтың белогі фазеолинді кодтайтын гендері бар күнбағыс өсімдігі еді.

Гендік инженерия гендерді тасымалдау тәсілі ретінде болашақта екпе өсімдіктердің селекциясының тиімді аспабы бола алады. Қазіргі кезде гендік инженерия алғашқы қадамдарын басып, екпінді дамып келеді.

Гендік инженерияның әдістемелік негізі жарықтың мезофилл жасушаларының немесе каллус ұлпасының протопластары болады. Жаңа генетиканың информацияға ие болған протоплаты өсіріп одан регенерант өсімдігін алуға болады. Генетикалық трансформация үшін сомалық жасушалардан басқа тозаң жасушалары, жұмыртқа жасушасы қолданылады. Сонымен, In vitro өсірілетін жасушаларға гендік инженерияның әдістерін қолданып, өсімдіктің бағалы белгілері бар негізінде жаңа формаларын құруға болады.

1.2. Гендік инженерияның жұмысы мынадай кезеңдерден тұрады:

1. 
   басқа организмге көшірілетін құрылымдық генді алу;
   
2. 
   оны вектордың құрамына енгізу, яғни рекомбинанттық ДНҚ жасау;
   
3. 
   рекомбинанттық ДНҚ-ын өсімдік жасушасына тасымалдау;
   
4. 
   өсімдік жасушаларында бөтен ДНҚ-ның экспрессиясын талдау;
   
5. 
   геномы өзгерген жеке жасушалардан регенерант өсімдігін алу.
   

Бөтен генді жасуша ішіне тасымалдап алып баратын арнаулы ДНҚ молекуласын вектор деп атайды. Оған мынадай талаптар қойылады:

1. 
   өз алдына репликациялану, яғни жасуша ішіне бөтен генді алып кірген соң жасушамен бірге немесе өзалдына көбейе алатын болуы керек; немесе вектор жасуша хромосомасының құрамына еніп, онымен бірге ұрпақ жасушаларға беріліп отыруы керек;
   
2. 
   трансформацияланған жасушаларды анықтау үшін оның ерекше генетикалық белгілері болуы керек;
   
3. 
   құрамында рестриктазалар үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек және репликацияға қабілетін жоғалтпауы керек;
   
4. 
   векторға орналастырылған бөтен ген оның атқаратын қызметін бұзбауы керек, ал вектор болса, ол да енгізілген геннің ішінде дұрыс реттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек;
   
5. 
   вектордың көлемі кішігірім болуы керек.
   

1975 жылы бұл мәселелер Халықаралық конференцияларда сөз болды, онда рекомбинантты ДНҚ молекулаларын алу сұрағына тоқталды. Онда биологиялық әр аумағын зерттейтін ғалымдар (медициналық микробиологтар, бактериальді генетиктер, эпидемиологтар, биохимикиер, ботаниктер, даму биологтар т.б.) жәнезаңгерлер, ақпарат көздерінің мүшелері, мемлекеттік және жеке өнеркәсіп иелері қатысты. Конференцияға қатысушылар гендік инженерия әдісімен жүретін эксперименттер жалғасуы керек деп шешті, бірақ белгігленген ережелер мен ұсыныстарды сақтауы қажет. Бұл ережелер келесі жылдары Англия, АҚШ, Франция мен басқа елдерде жасалынды. Олар бірнеше рет қайта қаралып, жеңілдіктер ұсынылды, себебі жинақталған мәліметтер олардың шектен тыс қаталдығын дәлеледеді, әсіресе дәстүрлі зертханалық штаммдармен жұмыс істеуге қатысты.

Генотипке әсер ету адам, өсімдік, жануарлар мен қоршаған орта үшін қайта қалпына келмес өзгерістерге ұшыратуы мүмкін. Бақылаудан шығып кеткен немесе арнайы дайындалған генетикалық агенттер, тіршілікті жоятын, әдейілеп қолданылуы оларды биологиялық қару деп қарауға құқық береді.

Дамыған елдерде азық-түлік сапасын бақылау оның шығаруына дейін жүзеге асады., ал дамушы елдерде – шыққаннан кейін.

Трансгенді өнімдердің шығуына тыйым салудан жеңілген кей ұйымдар енді оларға арнайы маркировка берілуін талап етіп отыр. ТМД елдерінде биоқауіпсіздік туралы заң қабылдауды – «Гендік-инженерия әрекеті аумағында мемлекеттік бақылау жүгізу туралы».

Қазақстанда гендік-инженерия өнімдері мен препараттарын маркілеу жөніндегі келісім шартқа қол қойды.

Генетикалық модифицирленген микроорганизмдерді қолдануға байланысты қатерді бағалау. Барлық микроорганизмдар адам үшін патогендік көзқарас тұрғысынан төрт қатерлі топқа бөлінеді:

1. 
   1 қауіп тобы: адам ауруын қоздырмайтындар
   
2. 
   2 қауіп тобы: олар мен кім жұмыс жасап отырғандарда ауру тудырады. Алайда микробтра жалпы алғанда азконтагиозды (мысалы, E. coli, Mycoplasma pneumoniae, адам папилома вирусы).
   
3. 
   3 қауіп тобы: адамда ауру тудырады және олармен жұмыс жасушаларға да қауіп тудырады. Қоғамда тарап кету қауіпі бар, бірақ алдын алу шаралары да бар.(Bacillus anthracis, Mycobacterium leprae, АИВ)
   
4. 
   4 қауіп тобы: олармен жұмыс жасушаларда ауру тударады, қоғамда тарап кету қауіпі бар, алдын алу шаралары жоқ. (мысалы – геморрагиялық безгек вирусы). 2-4 топтары патогендік микроорганизмдар біріктіреді. Топтың нөмірі қауіп түрін анықтайды және қорғаныс шараларын да қамтамасыз етеді. Бұл деңгей үшін GLP ( Good Laboratory Practice) ережелер міндетті. Мщдифицирленген генетикалық микроорганизмдерді ұстау деңгейін анықтау үшін « Генетикалық модификацияны халықаралық бақылау камитетінің ережелері» (1993) бар.
   

Иесінің түрін де есепке алады (жабайы, әлсіз, ауксотроф), промотор астында трансгенді құрылымды кіргізуші түр (максималды экспрессиялы, күшті, әлсіз, арнайы-сайт, дефектілі) және өнімдердің қатерлілігі (улы заттар, БАВ бұзушы әсері бар, аз бұзушы әсерлі, мүлдем әсерсіз, ДНҚ кодталмайтын бірізділігі).

1. 
   Гендік инженерия дегеніміз не?
   
2. 
   Биоқауіпсіздік туралы Халықаралық конференция қай жылы қабылданды?
   
3. 
   Гендік инженерияның жұмысы қандай кезеңдерден тұрады?
   
4. 
   Барлық микроорганизмдар адам үшін патогендік көзқарас тұрғысынан неше топқа бөлінеді?
   

Биотехнологияда оқшауланған жасушалар мен ұлпалар культурасының рөлін 3 бағытта қарастырады:

Оқшауланған ұлпалардың культивирлеуінің даму тарихы бірнеше сатыдан тұрады:

3.2. Оқшауланған ұлпалар культурасымен жұмыс істегенде негізгі шарт – қатал зарарсыздандыру, өйткені қоректік ортаға енгізілген фрагменттер (экспланттар) ұсақ ағзалармен оңай зақымдалады. Сондықтан эксплантты да, қоректік ортаны да зарарсыздандыру қажет. Оқшауланған ұлпалармен жұмыс асептикалық бөлмеде (ламинар-боксте) зарарсыздандырылған құралдармен жүргізіледі.

Кесте.

Бастапқы өсімдік материалын зарарсыздандыру (Р.Г. Бутенко, 1990)

Объект	Зарарсыздандыру уақыты
	Диацид, 0,1%	Сулема, 0,1%	Гипохлорид, 5-9%	Сутегі пероксиді, 10-12%
Тұқымдар: құрғақ бөртелген	15-20 6-10	10-15 6-8	15-20 6-8	12-15 6-8
Ұлпалар: тамыр, түйнек сүр. Сабақ	20-30 20-24	15-25 20-25	15-20 20-25	- -
Жапырақ	1-3	1-3	3-6	3-5
Апекстер	1-10	1-7	3-15	2-7

70 % этанолға бірнеше секундке эксплант алатын өсімдік мүшелерін салады. Тұқымдарды 1-2 минутке спиртке салады (зарарсыздандырғаннан кейін сумен дұрыстап шаяды). Ал эксплант мүшелерінің ішкі инфекциясын жою үшін антибиотиктермен өндейді.

3.3. Агарланған және де сұйық жасаңды қоректік орталарда өсірілетін өсімдік жасушаларының негізгі типі, ол көбеюге қабілеті бар каллус ұлпалары. Кез келген негізгі ұлпалардан пайда болатын каллус ұлпаларын өзіне лайықты қоректік ортада ұзақ уақыт бойы, тіпті шексіз өсәруге болады. Үзбей өсіру үшін әрбір 3-4 апта өткеннен кейін каллустарды жаңа қоректік ортаға отырғызып бағады.

Әр жасуша өсудің үш фазасын өтеді:

• 
  бөліну
  
• 
  созылу
  
• 
  дифференцировка
  

• 
  латенттік / лаг-фаза – жасуша белсенді түрде суды және қоректік заттарды сіңіреді де бөлінуге дайындалады;
  
• 
  үдеу фазасы – жасушалар бөлініп созылып өсе бастайды;
  
• 
  логарифмдік / экспоненциялық – бұнда өсу жылдамдылығы уақыт өткен сайын екі еселеніп үдейеді;
  
• 
  төмендеу фазасы – жасуша өсуінің салыстырмалы жылдамдығы бәсеңдейді;
  
• 
  стационарлық – өсуі тұрақты жүреді;
  
• 
  жасушалардың біртіндеп жойылып құру фазасы.
  

• 
  пролиферациялық – бөлініп жатқан жасушалар санының жалпы жасушалар санына қатынасы, митоздық индекс д.а.;
  
• 
  жасушаның созылу ұзақтығы;
  
• 
  циклға енген жасушаның жалпы күйі;
  
• 
  жеке жасушалардың бөліну саны
  

• 
  қоректік ортаның құрамы;
  
• 
  рН деңгейі;
  
• 
  оттегінің мөлшері;
  
• 
  температура, тығыздығы
  

1. 
   Жасушалық инженерия түсінігі, қалай жасалады?
   
2. 
   Протопластар қалай алынады?
   
3. 
   Протопластарды культивирлеу жолдары мен әдістері?
   
4. 
   Оқшауланған протопластардың бірігу әдістері?
   

Жасанды қоректік орта жағдайында, яғни іп vitro жағдайында өсімдіктердің барлық ұлпалар типтері жасушалары каллус жасушаларына айналады. Бұл процесс дифференциялану деп аталады, оның есебі фитогормондарға байланысты. Қөректік ортаның құрамын өзгерте отырып, ретсіз өсіп жатқан ұлпалардан регенерант- өсімдік алуға болады. Сонымен бір жасушадан тұтас бір өсімдікті өсіріп алуға болады, яғни өсімдік жасушалары ерекше касиетін – тотипотенттілігін көрсетеді.

Каллус ұлпаларының әр типті морфогенезге икемді болғандықтан оларды көптеп өсіреді. Каллустың түзілуі мен өсуін ауксиндер мен цитокиниңдер реттеп отырады. Көптеген жағдайда каллус түзілуі /индукциялау/ үшін кейінгі өсуге қарағанда ауксиндерді 10 есе артық қажет етеді. Каллус жасушалары өсу қарқындылығымен ерекшеленеді, түсі арқылы /ақ- ақшылдан -қара қоңырға дейін, тығыздығына қарай /бос- борпылдақ, тығыз, т.б. түрлері , жарықта түсін өзгертіп көгеретіндігімен тағы сол секілді белгілерімен бір-бірінен ажыратылады. Каллус ұлпаларды 3-4 апта өткеннен кейін, коректік ортадан шығарып алады да, бірнеше бөлікке бөліп, басқа жаңадан дайындалған қоректік ортаға отырғызылады, себебі қоректік ортаның күші әлсірейді, ұлпаның қоректенуі және ұлпаның ішкі бөліктерінің аэрациялануы төмендейді. Жаңа қоректік ортаның құрамы эксперименттің мақсатына байланысты болады, Егер каллустың бір қалыпты өсуін ұстап (сақтау) отыру керек болса, онда бастапқы қоректік орта құрамы өзгермейді.

Кейбір тәжірибелерде жасушалардың бір-біріне тигізетін әсерін ескере отырып, каллустарды өсірудің арнайы әдістері қолданылады. Қоректік ортада өсіру әдісінің бірі " бағушы" немесе " асыраушы қабат" , яғни бір каллус өсу үшін өсіру әдісінің бірі - екінші бір каллус ынталандырушы ретінде қолданылады. Бұндай жағдайда ұлпаны қоректік орта сіңген фильтр қағазына салады да, есімдіктің сол түрінің жаксы өсіп тұрған каллус массасына отырғызады. Кейде бір ыдыстың ішінде әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларын өсіруге болады. Кейбір жағдайларда ұлпаларды бір-біріне немесе мүшелерді ұлпаларға телуді қолданады. Жақсы өсіп тұрған ұлпалар мен мүшелерден бөлініп шыққан кейбір заттар, тәжірибеге алынған каллустың өсуін жылдамдатады.

Организм құрылысын жасайтын элементтердің жаңадан түзілуіне байланысты организмнің дене көлемі мен массасының қайтымсыз үлкейуі өсу деп аталады. Жасушаның, құрылымдық элементтері: органеллалар, мембраналар, макромолекулалар және метаболиттер,ұлпаны құрайтын-жасушалар,ал мүшелер-олардың құрамына кіретін әр түрлі ұлпалар типтерінен тұрады.Сонымен,өсу дегеніміз сандық жағынан тірі компоненттердің молекуладан организмге дейін көбейу процессі /молекулалар-жасушалар-ұлпалар-мүшелер-организмдер/.

Өсімдіктің өсуі жасушалардың, ұлпалардың және мүшелердің өсуінен тұрады. Солай бола тұрса да, қандай да болсын өсудің негізі жасушадан басталады. Жасушаның өсуі бірінен соң бірі кезекпен келіп тұратын процесстерден тұрады: жасушаның бөлінуі, протоплазманың өсуі, созылуы және дифференциялануы. Өсу процестері негізінен меристемада жүреді.

Меристемалар жылдам бөлінетін жасушалары бар түзуші ұлпа. Жасуша бөлінуінің көбірек кездесетін жолы митоз, ол төрт стадиядан тұрады: профаза, метафаза, анафаза, телофаза. Жасуша бөлінер алдында оның компоненттері екі еселенеді. Жасушаның бөліну циклінің, анық ең қолайлы маркері ол ДНҚ - ның мөлшері. Әрбір екі митоз аралығында ДНҚ - ның екі еселенуі /репликациясы/ жүреді. Жасуша циклінің түрлі фазалары мынадай символдармен белгіленеді, М, Оі , С₂ және 8 фазасы.

Жасуша циклінің М фазасы ядроның бөлінуі /митоз/ және цитоплазманың (цитокинез) бөлінуінен тұрады, осы фазадан кейін, жаңадан түзілген жасушалар жаңа жасушалық циклдің интерфазасына өтеді. Интерфаза О1 фазасынан басталады

Митоз кезінде төмендеген биосинтездік процесстер бұл кезде қарқынды түрде жаңадан басталады.Циклдің 3-фазасы ДНҚ-ы синтезделетін кезең, ядродағы ДНҚ-ы екі еселенгенде хромосомалар түгел репликацияланады /әрбір хромосома екі тең хроматидтермен тұрады/. Одан кейін жасуша С фазасына өтеді,бұл кезде жасуша бөлінуге дайындалады. М фазасы митоздан басталады да /атының шығуы осыған байланысты/ цитокинезбен аяқталады. М фазасының басталуы кезеңінде екі еселенген хромосомалар, енді тығызданып жарықтық микроскоптан көрінетіндей болады. Ядро қабығы бұзылады да хромосомалар ретті түрде орналасып жеке хроматидтерге жіктеледі. Жасушаның полюстерінде орныққан хромосомалардың сыртынан ядролық кабық пайда болады, жана ядролардың кайта құрылуымен қатар цитоплазма бөлінеді,бір ядросы бар екі жаңа жасуша түзіледі М фазасы цитокинез процессімен аяқталады да, келесі жасушалық циклдің интерфазасы қайта басталады.

Кейбір жас жасушалар митоздан кейін созылу фазасына ауысады.Созылу өзіне суды сіңіру аркылы жүреді,сонымен қатар бұл кезде белоктар нуклеин қышқылдары, көмірсулар, майлар және басқа заттар жаңадан түзіледі. Жаңадан бөлінген эмбриондық жасушаның жасуша қабығы және цитоплазма компоненттері түзіле бастайды. Жасушаның созылуы аяқталғаннан кейін келесі кезеңге дифференциялану яғни мамандану жағдайға ауысады.

Сонымен,жасуша бөлінгеннен кейін, әрбір жас жасушаның алдында үш мүмкіндік болады. 1/Эмбриондық жағдайда қалып, жасуша цикліне түсіп, митоз арқылы қайта бөліне алады. 2/Циклден тыс қалып, /О₀/бөлінбей, тыныштық кезеңіне өтеді. З/Компетенцияға иеленіп жаңа бағыты біртіндеп айқындалып одан кейін ерекшелену /дифференциялану/ жолына түседі.

Компетенция- жасушалардың, ұлпалардың, мүшелердің, организмнің индукторлық әсерді қабылдап алуға кабілеттігі және әсер еткен факторға жауап ретінде өзінің даму бағытын өзгертуі.

Өзгерістерді әр түрлі факторлар туғызуы мүмкін. Мысалы: гормондар,көрші жасушалардың немесе басқа ұлпалардың, метаболиттері, электрофизиологишшқ сигналдар және т.б.

Жасушаның белгілі бір тұқым куалауды жүзеге асыруға әзір тұру қалпына тусуі-детерминация деп аталады. Қабілеттілігі бар жасушалық детерминациялануы оның дамуының белгілі бір жолын калыптастырады да,жетілудің басқа бағыттарда жүруін тежейді.Қабілетті жасушаның детерминациялануы жасуша бөлшегінен кейін бірден басталуы мүмкін яғни протоплазманың өсуі алдында. Белгілі бір ретаен детерминацияланған жасуша өте бір тар мамандыққа ие болады яғни дифференцияланады (қандай да бір ұлпаның жасушаларына айналады).

Дифференциация - жас жасушалар арасындағы құрылысы мен кызметі жағынан болатын өзгерістерді,аналық жасушалары мен жаңа пайда болған жасушалар арасында айырмашылықтарды тудыратын күрделі процесс. Дифференциялану (дифференцировка) - жасушаның маманданған жағдайы, басқа жасушалардан ерекшеленуі. Дифференциялану деген түсінік ол эмбриондық жасушаның маманданған жасушаға айналуы дегенді білдіреді.

Меристемалық жасушалар атқаратын қызметі және құрылысы жағынан біркелкі, дифференциялану нәтижесінде әр жолдармен дами бастайды да,түрлі мүшелердің ұлпаларын түзеді. Жасушаның қандай да бір даму жолына тусуі, синтезделуі гендер аркылы басқарылатын белгілар құрамымен анықталады.

ДНҚ-ы молекуласында шифрленген генетикалық информацияның іске асуы арнайы и-РНҚ түзілуі /транскрипция/ арқылы және одан кейін генетикалық кодына сәйкес белоктар синтезі /трансляция/ арқылы жүретіні белгілі. Бірақ, барлық генетикалық информация бір уақытта іске аспайды, жасушаның өсу және дифференциялану процесстері кезінде қатаң тәртіппен кезектесіп көрініп отырады. Геномдағы гендердің бір тобы бір кезеңде активті болады, яғни иРНҚ-ның мағыналы өнімі бар, ал келесі бір тобы активтілігін көрсете алмайды, себебі, ондай гендер активтілігі репрессор әсерінен тежелген. Сондықтан, жасушалар арасындағы айырмашылықтар, яғни олардың дифференциаялануы гендердің әр түрлі дифференциалды/ активтенуіне байланысты.

Жасуша құрамындағы белоктар фенотипті және жасушаның қызметін анықтайды. Жасуша қасиетін, құрылыстарын транскрипция процессі кезінде иРНҚ-ы анықтайтын ферменттер мен басқа да белоктардың әсеріне байланысты болады. Бұл жағдай 2 суретте анық көрсетілген.

Жасуша ерекшеленіп маманданған жасушаға айналғанда, /дифференцияланғанда/ оның құрылысы және онда жүретін зат алмасу да өзгереді, ал гендер жиынтығы организмнің барлық даму кезеңінде өзгермей бір қалыпты болады. Жасушада жүретін өзгерістер тек гендер активтілігіне байланысты. Бүл жағдайдан жасуша ерекшеленген маманданған жасушаға айналуын /дифферанциялануын/ түсіну үшін, негізгі мәселені анықтауымыз қажет; неге бір типті жасушаларда гендердің бір бөлігі активті, ал басқа типті жасушаларда басқа гендер ахтивті.

Гендер активтілігінің реттелуі мынадай алты деңгейде жүруі мүмкін:

1/ ДНҚ-ы синтезделуі /редукцикация/ деңгейінде: 2/ РНҚ-ы синтезделуі /транскрипция/ деңгейінде: 3/ продессинг деңгейінде:

4/ и РНҚ~ның ядродан цитоплазмаға тасымалдану деңгейінде:

5/ рибосомалардағы трансляция деңгейінде:

6/ цитоплазмада иРНҚ-ның кері кету деңгейінде.

Гендер активтілігінің ДНҚ синтезі деңгейінде реттелуі гендер репликациясының бір қалыпты жүруін бұзуы мүмкін, сондықтан әр түрлі жасушалардағы гендер жинағы да бірдей болмайды. Сонымен бірге гендер активтігі ДНҚ-ның күйі өзгеруіне де тәуелді. Гендер активтілігіне әсер ететін, ДНҚ-ның тұрақты өзгерістерінің үш типі белгілі. Біріншіден, хромосомадағы гендердің өзара орналасу ретінің өзгеруі, олардың атқаратын қызметіне әсер етуі мүмкін. Транслокация немесе инверсия кезінде ген орын алмастырып ДНҚ-ның басқа бөлігі арасына орналасады. Бұл жағдайда ген активтілігінің төмендеуіне немесе өте жоғары деңгейде көрінуіне әкеліп соғады. Гендердің орын алмастыру құбылысын, яғни жылжымалы генетикалық элементтерді алғаш рет Барбара Мак-Юшнток 1947 жылы ашқан. Кейінгі кезде белгілі болғандай транспозондар немесе жылжымалы генетикалық элементтер бір хромосомадан басқа хромосомаға орын ауыстыра алады, осыған байланысты гендердің жоғары дәрежеде мутациалануын жүргізеді немесе бұрын активтілігі жойылған гендердің активтілігін арттыра алады. Екіншіден, геномдағы қандай да бір геннің санының көбеюі де /амплификация/ геннің іске асу дәрежесіне /экспрессиясына/ әсер етеді. Өте жиі амплификацияға ұшырайтын рРНҚ- ның гендері. Геномдағы бір гендердің көбеюінің /амплификациясының/ жасушаның ерекшелініп маманданған жасушаға айналуындағы /дифференциялануындағы/ рөлінің қаншалықты маңызы бар екендігі өлі белгісіз. Үшіншіден, ген кұрылысының сапалық жағынан (мутация, делеция) өзгеруі мүмкін.

Прокариоттардағы транскрипция деңгейіндегі белок синтезінің реттелуін Жакоб және Моно жасаған оперон (бір репрессордың бақылауындағы гендер тобы) моделі жеткілікті дәрежеде түсіндіріп береді. Эукариоттар гендерінің активтілігінің реттелуін зерттеуше қиын, себебі, геномы күрделі және көлемі үлкен. Эукариот гендерінің дифференциялды активтілігі транскрипция денгейінде геномның белгілі бөліктерінің ашылу немесе көріну жолымен реттелуі мүмкін, яғни матрицадан информация алудың мүмкіншілігі өзгеруі арқылы.

Жоғарғы сатыдағы организмдер гендерінің реттелуі туралы гипотезаны Бритген мен Дэвидсон жасаған. Олардың болжауы бойынша гендердің экспрессиясының реттелуі ядрода алғашқы иРНҚ-ның кайсысы сақталып қалып, процессингке ұшырап, кейін цитоплазмаға өтетіні анықталған кезінде жүреді.

Цитоплазмаға өткен и РНК-ның трансляциясы бірден жүрмейді. Эукариоттардың эволюция барысында қол жеткізген жетістіктерінің бірі информосомалар. Информосомлар белок синтезінің реттелуін қамтамасыз етеді. Гендер экспрессиясының реттелуінің тағы бір кезеңі, ол трансляция процессі. Бірақ трансляция деңгейінде реттелу механизмдері туралы деректер жоқ деуге болады.

Сонымен, өсімдіктерде жүретін дифференциялану процессі өсімдіктердің қандай да бір бөліктерінің немесе тіршілік циклінің кез келген стадиясында өтетін гендер экспрессиясының айырмашылықтары арқылы анықталады.

Морфогенез дегеніміз пішін /форма/ құру процессі, яғни өсімдік мүшелерінің бастапқы элементтерінің құрылуы, өсуі және өнуі /органогенез/, ұлпалардың /гистогенез/ жөне өсімдік жасушаларының жетілуі /цитогенез/ немесе жасушаның дифференциялануы. Сөйтіп, морфогенез көп кезеңдерден тұратын күрделі процесс.

Организмнің дамуы - өсу, дифференциалануы, морфогенез процесстерінің бір - бірімен тығыз байланыста жүруінің нәтижесінде болады. Бүтін организмде бүл процесстерді бір - бірінен ажыратып қарау өте қиын. Сонымен қатар, бұл процесстер бір - біріне мүлде ұқсамайды, әрқайсысының өзіндік ерекшеліктері бар. Сол себепті, морфогенез процессін түсіну үшін оны өсу мен дифференциациядан бөлек алып қарау қажет. Сонымен қатар, морфогенез өсу мен дифференциациясының арқасында жүретінін естен шығармау қажет. Атап айтқанда сандық өзгеріс және сапалық жағынан қайта құрылудың нәтижесінде кеңістікте құрылысы және формасы бар құрылым пайда болады, яғни морфогенез процессі жүреді.

К. Уоддингонның анықтамасы бойынша, "Морфогенез дегеніміз - гомегендік, яғни жеке бөліктерден тұрмайтын массасының белгілі бір құрылымға айналуы". Тұтас организмде әр түрлі бөліктердің бір - біріне тигізетін әсерін камтамасыз ететін, көптеген корреляциялар, байланыстар болғандықтан, бұндай жүйеде морфогенездің көрінуін зерттеу өте қиын шаруа .

Морфогенезді зерттеудің өте қолайлы моделі, ол ұлпаларды, жасушаларды және протопласттарды жасанды қоректік ортада өсіру. Моделді қолданып жүргізген зерттеулердің артықшылығын, ол өсірілетін жасушаларға бір бағытта әсер ету арқылы, зерттеуші түрлі факторлардың әсерін бақылай алады.

1. 
   Каллус туралы жалпы түсінік?
   
2. 
   Компетенция дегеніміз не?
   
3. 
   Меристемалық жасушалардың атқаратын қызметі?
   
4. 
   Гендер активтілігінің алты деңгейін сипатта.
   

Дедифференциялану калай жүреді? Р.Г.Бутенконың келтіруі бойынша, қоректік ортада өсірілген темекінің өзектік паренхима жасушаларының дедиф- ференциялануы, қоректік қор заттарды пайдаланудың және жасушаның арнайы маманданған органеллаларының бұзылуынан басталады. Маманданған жасушаның өз қасиетін жоя бастағаннан /дедифференциялану/ кейін 6-І2 сағ. өткен соң олар жасушаның нәзік құрылысында болатын өзгерістерді бақылаған. Жасуша қабығы жұмсарып, ісінген, рибосомалар саны, эндоплазмалық тор және Гольджи аппараты элементтерінің саны өскен, ядрошықтың көлемі және саны көбейген. Жасушаларда тРНҚ және рРНҚ синтезі артып, ДНҚ синтезі басталған, жаңадан түзілген белоктардың мөлшері көбейген. Бастапқы ұлпаларға тол емес, арнайы белоктардың-антигендердің пайда болуы, әсіресе тұтас темекі өсімдігінің меристемалық белогының біріне сәйкес белоктың синтезделуі анықталған. Осы өзгерістердің барлығы, одан кейінгі жасушаның бөлінулері тек ортада ауксиндер мен цитокининдердің катысуымен ғана жүреді. Жасуша бөлінулері 48-72 сағат өткеннен соң басталатыны белгілі болды. Дмитрева Н.Н мен Линский А.Х. темекінің өзектік паренхима жасушасың циклді бөлінуіне гормондар әсерінің мерзімдік жүйелілігін анықтады, ол үшін ауксин мен кинетин әсері жеке-жеке зерттелді. Қоректік ортаға бір ғана ауксинге қосылған жағдайда, РНҚ және ДНҚ синтезделуі күшейгенімен, жасушалардың бөлінуі байкалмады, төрт күндік латентті / жасырын / фазадан кейін жасуша созылып өсуге айналды. Қоректік ортада тек бір ғана кинетин қосылған жағдайда нуклеин қышқылдары синтезінде ешқандай өзгерістер байкалмаған. Жасушаның бөлінуіне кажет барлық процесстер жүру үшін, ауксиннен кейін кинетиннің әсері болу керек немесе екеуінің қосылған әсері қажет. Зерттеулерден кейін мынадай қорытынды жасауға болады, жасушаның бөліну процессін тек кинетин бастап жібереді. Р.Г.Бутенконың үйғаруы бойынша жасушаның бөлінуі төменгі жағдайларды қамтиды: жасушалардың көбею стимуляторы /ауксин/ әсерінен жасушаның сырткы мембранасы плазмалемманың өткізгіштігі артады да, оның қасиеттері өзгереді. Осыдан соң бұрыннан бар болған немесе жаңадан синтезделген матрицалық РНҚ-да цитоплазмалық белоктардың түзілу барысы активтенеді. Түзілген белоктар цитоплазмадан ядроға өтеді, арнайы гистондық белоктармен ерекше байланысқа түседі де , транспорттық және рибосомдық РНҚ-лары ситезделуіне жауапты локустарды іске қосады. Жасушадағы РНҚ-ның мөлшері белгілі бір сатылы деңгейге жеткенде ДНҚ-ның репликациясы басталады. Ортада кинетин болмаған жағдайда жасушаның митозға өтуі болмайды. Шамасы, кинетин жасушаның митозға өтіп бөлінуін аяқгау үшін қажет, арнайы РНҚ-лары мен белоктардың сиитезделуін белгілейтін болу керек. Ондай бөлінуге ықпал жасайтын премитоздық кезеңде синтезделген белоктың және оған сәйкес информациялық РНҚ-ы бар екендігі жануарлар жасушаларында дәлелденген.

Сонымен кез келген жасушаның өзгеріп, каллустық жасушаларға айналуының алдында, көптеген күрделі биохимиялық және структуралық кайта құрылулардан өтеді. Дегенмен, өсімдік жасушаларының маманданған касиетін жойып, бөліне бастау /дедиференциялану/ процессінің терең механизмдері жете зерттелген жоқ.

Жаңа өсімдік материалынан бірінші рет каллус алу өте қиын, себебі әр түрлі өсімдіктердің ұлпалары, тіпті бір өсімдіктің әр бөлігінен алынған ұлпаларының дедиференциалануы және каллусогенезі жүру үшін, әр түрлі қоректік орталарды талап етеді, әсіресе ондай талап гормондардың мөлшері мен ара қатынасына қойылады. Кейбір өсімдіктердің, ұлпаларын кайталап отырғызып ұзак, мерзімде өсіргенде, ондай ұлпалар әжептәуір мөлшерде ауксин мен қатар цитокининді синтездеу қабілетіне ие болады, яғни бұл гормондарға байланысты автотрофтарға айналады. Бұндай каллус жасушалары "қалыптасқан",-деп аталады. Гормондарға тәуелсіз штаммдардың пайда болу себебі өлі белгісіз. Олардың шығуы мутациялардың әсерінен, немесе жаңа гендердің іске қосылуынан болуы мүмкін. Ісік жасушаларын жасанды ортада өсіргенде, оларда гормондарға тәуелсіз.

Жасушаларды қоректік ортада өсіргенде каллустық жасушаларға айналады, бірақ ондай жағдайда барлық жасушалар біркелкі болмайды. Жасанды ортада өскен жасушалардың түрлілігі/гетерогенді/ морфология, физиология және генетика түрғысынан болуы мүмкін.

Каллус жасушаларының бастапқы ұлпа жасушаларынан және бір-бірінен өлшемі және формасы жағынан айырмашылыктары бар, олардың ядросының саны мен формасы тұрақты емес. Қоректік ортада өскен жасушалардың полиморфизмі мынадай себептерден пайда болуы мүмкін. Түрдің және өсу мерзіміндегі ерекшеліктері, алғашқы плоиттылық деңгейі, қоректік орта құрамы және өсіру жағдайларының тигізетін әсері, клетклар арасында корреляциялық байланыстардың жойылуы. Қартайған каллустың жасушаларының мөлшері өте үлкен шамаға дейін жетеді/500-1000мкм/, жас жасушалардың мөлшері айтарлықтай кіші/15-30мкм/. Ортада кинетин болмаған жағдайда көбінесе жасушалардың мөлшері үлкейеді. Жасушаның пішіні мен мөлшерінің және ядроларының өзгеруі, ол плоидтылығының көбеюіне байланысты. Жасушаларды жаңа ортаға қайталап отырғызып өсіру /пассаж/ саны көбейген санын плоидтылығы артатыны дәледденген.

Физиологиялық әр түрлілік деген ол популяциядағы клекалардың әртүрлі физиялогиялық жағдайында болуы, яғни олар бөлінеді, өседі, картайып, өледі. Сейтіп ортада өскен жасушалар асинхронды келеді /бөлінуі бір уақытқа сәйкес келмеуі/. Жоғары сатыдағы өсімдіктер популяциясындағы жасушаларды жасуша циклі фазаларын бір кезде өтуге мәжбүр ету, яғни синхрондау мүмкіндігі жок деуге болады. Себебі, бір мезгілде бөлінуге қабілетті жасушалардың бөлігі 2-4 құрайды. Қолайсыз жағдайлар төменгі температура, қоректік ортада негізгі компоненттердің жетіспеуі жасушалар бөлінуін тежейді және бөлінуге дайын жасушалар санының көбеюіне себепші бола алады. Жасушаны бөлуге дайындық кездерінің бірін тежейтін химиялық заттарды қолданған тиімді. Клекалардың бөлінуінің синхрондалуының жоғары деңгейі 10-30%-ке жетуі мүмкін, бұл өте жақсы жағдай, бірақ келесі бөлінулер кезінде популяция өзінің бір мезгілде бөліну қасиетін тез жояды.

Көңіл аударатын жай, ол сұйық қоректік ортада /суспензияда/ өскен жасушалардың физиологиялық өзгергіштіктері, агарланған қатты ортада өскен каллустың ұлпаларымен салыстырғанда төмен. Ол жасушалардың қоректену мен аэрациялау жағдайларының бір келкілігіне және жасушалар бөліп шығаратын зиянды зат алмасу өнімдерінен, сұйық араласып тұрған ортада оңай құтылуына байланысты.

Жасанды қоректік ортада өскен жасушаларға цитогенетикалық тұрақсыздық та тән. Бір ыдыста өсірілген, бір ұлпа жасушаларыньң хромасомалар бір-бірінен айтарлықтай айырмашылығы /диплоидтар, полиплоидтар, анеуплоидтар/ болуы мүмкін. Генетикалық өзгергіштіктің себебі әр алуан. 1. Өсімдіктен бастапқы эксплантты бөлген кезде үйлесімді /коррелятивтік/ байланыстардың бұзылуынан, 2. қоректік орта компоненттерінің әсерінен, 3. коректік ортаға бөлінген метаболизм өнімдерінің әсерінен, 4. сегізгі материалдың гетерогенділігі және бөлгіш жасушалар типтерінің сұрыпталуы.

Жасанды жағдайда өсірілген жасушалардың цитогенетикалык гетерогенділік механизмі жалпы түрде анықталған. Оларға жататындар: 1/ жасушалық сұрыптау процессі; 2/ жасушалардың бөлінуінде эндомитоз бен эндоредупликация құбылыстары; 3/ митоз кезінде жасушада жүретін жағымсыз өзгерістер. Жоғарыда келтірілген үш процесстің әр қайсысы бір-бірінен тәуелсіз жүре алады. Жасушалық сұрыптау, ол популяциядағы жасушалардың белгілі типінің көбейіп басым болуы. Ондай басым болу жасушалардың бір бөлігінің айрықша бөлінуінен немесе басқа жасушалардың тез жойылуынан болуы мүмкін. Эндомитоз және эндоредупликация /басқа атаулары эндоциклдер/ тек қана жасушаның жаңадан түзілуіне, яғни пролиферацияға байланысты болады. Бұл екеуі де митоздың формалары, олардың ерекшелігі ол карио және цитокинездің өтпейтіндігі, және ядродағы ДНҚ-ның мөлшері геометриялық прогрессия бойынша көбейетіндігі. Қалыпты митоздың бұзылуы мен хромосомалардың дұрыс бөлінбеуі, полиплоидтық және анеуплоидтық жасушалардың түзілуіне әкеліп соғады.

Ең негізгі себептердің бірі, шамасы, ол бүтін организмнен бақылау болмауына байланысты болу керек, яғни корреляциялық байланыстардың бұзылуы себебінен жасушалар өзгереді. Тіршілікке қабілетті полиплоидтық жасушаларды сұрыптау арқылы, жасушалар популяциясы жаңа жағдайға бейімделеді. Жасанды қоректік ортада өсіру жағдайы өзгергенде, сұрыптаудың бағыты да өзгереді, бұл ескеретін жағдай. Мысалы, ортадағы 2,4-Д және юшетиннің жоғары концентрациялары жасушалардың полиплоидтану мумкіндігін арттыратыны анықталған.

Жасанды ортада өсіру жағдайынын цитогенетикалық көп түрліліктің /гетерогенділігін/ пайда болуына әсер ететіндігін гаплопаппус өсімдігі ұлпасымен жасалған тәжірибеден анық көруге болады. Осы өсімдіктің меристемалық жасушалары Р.Г.Бутенконың лабораториясында екі жыл бойы үзбей әрбір ай сайын жаңа ортаға отырғызу арқылы өсірілген. Сондықтан да, негізгі өсіруге алынған диплоидты жасушалардың 95%-і жоғары плоидтылықка айналған. Осы ұлпамен жұмыс жасаған швед зерттеушісі Эриксон, әрбір екі күн сайын жаңа қоректік ортаға отырғызып отырған. Бұндай жағдайда штамм бір қалыпты диплоидты күйін сақтап калған. Дегенмен, өсімдіктерді өсіру тәсілдері жасушалар популяциясының генетикалык тұрақтылығының толық кепілі бола алмайды, себебі негізгі материаддың екінші генетикалық әртүрлілігі, болуы әбден мүмкін. Көптеген өсімдіктердің дифференциалданған ұлпалары жасушаларының диплоидтылығы әр түрлі. Маманданған жасушалар, мысалы, жарық сәулесін сіңіретін жасыл жапырак паренхимасы, тамырдың етженді қорлық ұлпалары, түйнектер жасушалары көбінесе полиплоидтык, Тек белсенді түрде бөлініп жатқан жасушалар әр уақытта диплоидтылығын сақтап қалады.

Егер негізгі материал ретінде диплоидтық меристемалық жасушалар алынған болса және оларды үзілмейтін ағын коректік ортада өсірсе, сонда ғана олардың генетикалық тұрақтылығын сақтауға кепілдік бар. Экономикалық жағынан тиімді, қажеттігі зор, түрлі заттар алу мақсатымен ұлпалардың өте үлкен массасын өсіргенде, клонның генетикалық тұрақтылығын сақтаудың маңызы зор. Жасушаларды жасанды түрде өсіру барысында, өсімдіктің негізгі түрімен генетикалық пара-парлықты сақтау, бірегей, генетикалық жағынан бағалы өсімдіктер формаларын көбейткенде қажет екендігі белгілі. Сонымен қатар, жасушаларды модель ретінде физиологиялық және биохимиялық процестерді зерттеу үшін қолданғанда да олардың генетикалық тұрақтылығының маңызы зор. Демек, жасушаларды қоректік ортаға бірнеше қайталап отырғызып, өсіріп тіршілігін сақтағанда, оларда морфологиялық, физиологиялық, цитогенетикалық әртүрлілік пайда болады. Кайталап отырғызбай жасушалар штаммдарын өзгеріссіз сақтау жолының бірі мұздатып алып өте төмен температурада /-196°С /, яғни криогенді әдіспен сақтау.

Қалай дегенмен, жасанды ортада өсірілген ұлпалардың -генетикалық гетерогендігінің пайдалы жақтары да бар, ол жасушалардың адаптациялық мүмкіншілігін арттыратындығы. Жасушаларды жасанды қоректік ортада өсіргенде, полиплоидтық жасушалардың өздігінен сұрыпталуы /автосұрыптау/, яғни полиплоидтық жасушалардың спонтанды /табиғи/ сұрыпталуы жүреді. Ондай сұрыпталған жасушалар тіршіліктің жаңа жағдайларына тезірек бейімделе алады. Бұдан басқа, табиғи немесе қандай да бір факторлар әсері арқылы индукцияланған, өсімдіктердің түрліше варианттары бар формаларының пайда болуын, казіргі уакытта қолданып жүрген ауылшаруашылық дақылдарының сапасын жақсарту үшін колдануға болатыны. Қоректік ортада өсіріліп алынған жасушалар линияларының немесе регенерант өсімдіктердің көп түрлілігі сомаклондық өзгергіштік нәтижесінде пайда болады, оларды сомаклондык варианттар деп атайды. Сомаклондық өзгергіштік -өсімдік жасушаларының ядролық және органиодтық геномдарының тұрақты еместігінен болатын фенотиптік өзгергіштік.

Агарланған және де сұйық жасанды қоректік орталарда өсірілетін өсімдік жасушаларының негізгі типі, ол көбеюге қабілеті бар каллус ұлпалары. Кез келген негізгі ұлпалардан пайда болған каллус ұлпаларын өзіне лайықты қоректік ортада ұзақ уақыт бойы, тіпті шексіз өсіруге болады. Үзбей өсіру үшін әрбір 3-4 апта өткеннен кейін каллустарды жаңа қоректік ортаға отырғызып /пассаж жасап/ бағады. Дүниежүзінің көптеген лабораторияларында ондай каллустар өсірілуде. Мысалы, 1938 жылы сәбіздің тамыр жемістерінен Р.Готре алған каллус күні бүгінге дейін өсірілуде. Ескертетін жағдай, өсімдіктердің жеке жасушалары олардың кішкене топтарын /агрегаттарын/ өсіргенде, өсуге қажет қоректік заттарға қоятын талабы қатты ортадағы жасушаларымен салыстырғанда жоғары болады, өйткені агардағы жасушалар өзі тәріздес жасушалармен қоршалған. Жеке жасушалар араластырылып тұрған сұйық қоректік ортада бөлінуі үшін қажет, қандай да бір заттарын жоғалтады, сондықтан сұйық қоректік ортада өсірілетін жасушалар үшін орталардың құрамы өте құнарлы болу керек. Агарланған ортаға отырғызылған жеке жасушалар бөлінуге өту үшін, көмек ретінде "бағушы" ұлпаларды немесе "асыраушы қабаты" болуын қажет етеді және ортаға отырғызылатын жасушалар тығыздығы белгілі бір мөлшерден төмен болмау керек. Сұйық қоректік ортада өсетін бірен-саран жасушалар басқа жақсы өсіп жатқан жасушаларының ортасын қосқан соң ғана бөлініс бастайды.

Бүтін организмдер сияқты жасанды ортада жасушалардың өсуі 3 -тәрізді қисық сызықпен бейнеленеді және ол мынандай фазаларды қамтиды:

I/ латенттік немесе лаг-фаза, бұл фаза кезінде жасушалардың көрінетіндей өсуі болмайды, бірақ жасуша белсенді түрде суды және коректік заттарды сіңіреді де бөлінуге дайындалады. 2/ үдеу фазасы, бұл кезде жасушалар бөлініп созылып өсе бастайды; 3/ логарифмдік немесе экспоненциялдық фазасы, түзу сызыкпен бейнеленетін өте қысқа фаза, бұнда өсу жылдамдығы уакыт өткен сайын екі еселеніп үдейді; 4/ Жасуша өсуінің төмендеу фазасы, бұл фазада жасуша өсуінің салыстырмалы жылдамдығы бәсеңдейді; 5/ стационарлық немесе бір сарынды фазасы, бұл кезде жасушаның өсуі жылдам болмаса да тұрақты жүреді; 6/ жасушалардың біртіндеп жойылып құру фазасы.

Жасушалардың бір фазадан басқа фазаға ауысуы ішкі және сыртқы факторлардың катысуымен бақыланады. Ішкі факторларға жататындар: пролиферациялық қоры; жасушаның созылу ұзақтығы; циклға енген жасушаның жалпы күйі; жеке жасушалардың бөліну саны. Пролиферациялық қоры деп бөлініп жатқан жасушалар санының жалпы жасушалар санына қатынасын атайды. Бұл ара қатынасты процентпен белгілесе, онда ол митоздық индекс деп аталады.

Сыртқы факторларға жататындар : қоректік ортаның құрамы, рН-тың деңгейі, оттегінің мөлшері, температура, отырғызылған жасушалар мен ұлпалардың тығыздығы, т.б. факторлар.

Жасушалар мен ұлпаларды жасанды ортада өсіргеңде барлық жасушалар бірдей бөлінбейді, сондықтан пролиферациялық қоры төмендейді. Оны мынадай себептермен түсіндіруге болады:

1) жасушалардың қайтымсыз дифференциялануы;

2) жасушалардың С кезеңіне өтуі (циклден тыс немесе тыныштық кезеңі);

3) жасушалардың кұруы. Жасушалардың бөлінуі арқылы өсуі мен бір бөлігінің өліп жойылуы теңелгенде, жасанды ортада өсрілген жасушалар стационарлық (өсуі бір қалыпты өзгермейтін) күйде болады.

Өсу процессін түрлі факторлардың қатысуымен реттеуге болады және мынадай көрсеткіштер арқылы бақылауға болады: өлшем, көлем, масса, жасушалар саны, белоктың және ДНҚ-ның мөлшері. Тәжірибенің мақсатына байланысты, келтірілген көрсеткіштердін, біреуі қолданылады. Жасушалардың өсуін зерттеп білу үшін, белок пен ДНҚ мелшерін белгілі бір әдістермен анықтаған ыңғайлы және оны жасушалар санын анықтағанда да қолдануға болады.

1. 
   Жасушалардың іп vitro жағдайында дифференциялануы морфогенезі
   
2. 
   Жасушалардың регенерациялану ерекшеліктері.
   
3. 
   Жасанды ортада регенерант өсімдігі пайда болу құбылысы
   

Өзіне тән бір қалыпты өсуімен және көбеюімен сипатталынатын ретсіз өсетін каллус жасушалары қайта дифференциялану процестері арқасында, ұлпалар (гистогенез), мүшелер (органогенез) және ұрық тәріздес құрылымдар-эмбриондар (эмбриогенез, немесе сомалық эмбриогенез) түзе алады.

Бастапқы кезде каллус өсіп, массасы қандай да бір ауыспалы кезеңге жеткеннен кейін морфогенезге ауысады. Бірақ, тек бірлі жарым санаулы жасушалар ғана, өзінің даму бағдарламасын өзгертеді. Бұл, мына жағдайды көрсетеді, ретсіз өсетін каллус жасушалары морфогенезге өту үшін , сыртқы және ішкі факторлардың біріккен әрі үйлескен әрекеті қажет. Сөйтіп, бірен-саран комлементті жасушалар сыртқы факторлардың әсерін (түрлі индукторлар) қабылдап, белгілі бір даму жолына түсуге дайын болып тұрады, яғни детерминацияға өтеді. Ал содан кейін олар өзінің тұқым қуалау бағдарламасын жаңа бағытпен жүзеге асыра бастайды, ақырында каллус жасушалары редифференцияланады. Редифференциялану деген дифференцияланған жасушалардың бір маманданған жағдайынан басқа жағдайға ауысуы. Ол өте күрделі процесс, сыртқы және ішкі факторлардың катысуымен реттеледі.

Ретсіз өсетін каллус ұлпасынан ұйымдасқан құрылымдарға, атап айтқанда өскінге, тамырға, эмбриондарға бастама болатын меристемалық аймақтардың пайда болуына әсер ететін факторлардың мәні туралы анық түсінік әлі жоқ.

Мүмкін, жасушалардың дифференциялануын қозғайтын және олардың гистогенезге өтуін, одан кейін мүшелер түзетін құрылымдардың түзілуінің негізгі себептерінің бірі, фотогормондардың әсері деуге болады. Дегенмен морфогенездің қандай да бір типін анықтайтын негізгі факторлардың бірі ол қоректік ортадағы ауксиндер мен цитокининдердің ара қатынасы. Бұл заңдылықты алғаш рет Скуг пен Миллер 1957 жылы ашқан, одан кейінгі жылдары көптеген тәжірибелер арқылы дәлелдетілген.

Ауксин мен цитокининнің ара қатынасы орташа болғанда темекі өсімдігінің каллус ұлпасында морфогенез процессі байқалмайды, бірақ жасушалардың бөліну арқылы көбеюі (пролиферациясы) жүреді. Ортада ауксиннің цитокининге ара қатынасы жоғары болса, тамыр түзілуін (ризогенезді) қоздырады, ал ортада ауксиннің цитокининге ара қатысы төмен болған жағдайда бүршіктердің пайда болуын (геммогенез) ынталандырады. Сонымен бір каллустың өзінде әр түрлі морфогендік құрылымдар түзіле алады. Бұл жағдайлар кактустық ұлпаларда фитогормондардың кондентрациялық градиенті (концентрацияның үздіксіз өзгеруі) түзілетіндігінің дәлелі бола алады. Былайша айтқанда, каллустың әр түрлі бөліктеріндегі фитогормондар мөлшері әр шамада болғандықтан, ол морфогенездің қандай да бір типінің басталуына себеп болады.

Сөйтіп пайда болатын меристема типі ортадағы ауксин мен цитокининнің ара қатынасына байланысты екені белгілі, бірақ морфогенездің түрлі этаптарында қайсысының қатынасатындығы туралы анық дерек жок, Алайда, бірқатар өсімдіктер каллустарынан ортадағы фитогормондар балансын қанша өзгерткенмен бүршік немесе тамыр өсіріп алу мүмкін емес. Бүршіктің немесе тамырдың дифференциалануы гормондар әрекеттесуден реттеледі десек те, оған басқа да факторлар, мысалы: қоректік ортадағы қанттар мен фосфаттардың мөлшері, азоттың көзі, пуриндер т.б. ортаның құрамына кіретін компонеттер әсер етуі мүмкін.

Өткізгіш жүйенің элементтері пайда болуына тек қана гормондар әсер етіп қоймайды, сонымен бірге қанттар да ықпал етеді. Каллус ұлпаларына ауксин - қант ерітінділерін инъекция жасағанда өткізгіш элементтері түзілген. Ол ауксин концентрациясына да және қант концентрациясына да тәуелді болады. Сахарозаның төмен концентрациясын (2 %) енгізгенде көбінесе ксилема элементтері, ал жоғары концентрациясында (8 %)-флоэма элементтері пайда болады. Сахарозаның орнына глюкозаны колданғанда гистогенез жүрмеген. Скуг және Миллер ашқан факт, ол темекінің каллус ұлпаларынан жасанды ортада бүршіктер мен тамырдың өсуін экзогендік фитогормондар балансы арқылы реттелетіні, морфогенезді іп vitro жағдайында зерттеуде маңызды роль атқарды. Дегенмен, бұл құбылыстың, жасушалық және молекулалық деңгейдегі механизмі әзірше анық емес.

Фитогормондардың морфогенезге әсерінің механизмдері туралы нақтылы білім жок, сондықтан жаңа өсімдіктерді жасанды түрде қолдан өсіргенде қайтадан гормондардың үйлесімді арақатынасын және құрамын іріктеп алу керек. Астық тұқымдастар және кейбір бұршақ тұқымдас өсімдіктердің жасушалары мен протопластарын іп vitro жағдайында өсіргенде, оларда морфогенез процессінің басталуына әсер ететін, оңай әрі регенеранттарды алу үшін гормондардың қажетті концентрациялары белгісіз. Осындай фактілер және де көптеген әдебиет деректеріне карағанда, жасушаның дифференциалануын және морфогенезді реттеуде фитогормондардың ерекшелігі жоқ деген түсінік туындайды да, морфогенездің гормондық теориясына сенімсіздік пайда болады. Т. Мурасигенің көрсетуі бойынша Скуг пен Миллердің концепциясы органогенез процессі жөніндегі түсінікті жеңілдетеді. Даму бірнеше этаптардан тұратын, өте күрделі процесс, этаптардың әрқайсысында гормондарға, жарыққа, температураға қойылатын талаптар да өзгеріп отырады. Мурасигеннің пікірі бойынша, өсімдіктердің жасанды ортада өсуіне әсер ететін басқа да заттарды ескеру қажет, ол заттарды ортаға жасушалар мен ұлпалардың өздері бөледі, олар улы болғандықтан, морфогенезді тежеуі мүмкін. Сөйтіп, іп жағдайында өсетін жасушалардың дифференциалануы мен морфогенезінің барлық реттелу бағыттарын, жалғыз гормондық концепциямен түсіндіру мүмкін емес. Коректік ортадағы өскен ұлпалар мен жасушалардың морфогенезге өту қабілеті негізгі өсімдіктің генотипіне, оның физиологиялық күйіне, эксплант алынған мүшеге, жыл мерзіміне тағы басқа химиялық және физикалық факторларға тәуелді.

Р. Г. Бутенко өз лабораториясының осы бағыттағы жұмыстарының нәтижелерін және әдебиеттердегі бар деректерлі тұжырымдай келіп, каллустардағы меристемалық аймақтардың пайда болуын төмендегідей баяндайды. Индуктордан келетін снгналды қабылдап алуға қабілеті бар жасушалар көп емес, олардың ерекше бір даму жолына түсуге дайындылығы ертеден белгіленеді. Бұл жасушалар детерминация кезеңінде бөлінуін токтатады, қалыңдау жасуша қабығын түзіп, өзін қоршап тұрған каллустық жасушалардан оңашаланады. Бұл кезеңде жасушалар кейінгі өзінің тез бөлінуіне кажет субстрат және энергия жинақтайды. Паренхима тәрізді каллус жасушалары массасынан пайда болған бастама жасушалар, өзін қоршап тұрған жасушаларға қарағанда морфология жағынан өзгеше болады. Олардың ядросы үлкейеді және сол сияқты ядролық - плазмалық арақатысы да, рибосоманың, митохондрияның саны көбейеді, пластидтерінде крахмал жинақталады, Сөйтіп, өсімдіктердің бастапқы маманданған жасушалары каллусқа айналған кездегідей /дедифференцияланғанда/, каллустың жасушасы меристемалық жасушаға айналғанда толығымен өзінің ішкі құрылымын қайта құрайды. Біраз уақыт өткеннен кейін, бұл жасушалар бөлшектену типімен тез бөліне бастайды да, меристема типті ұсақ жасушалардың сфералық массасын түзеді. Одан әрі қарай бұл жасушалар массасы өскін немесе тамыр бастамалары түзілетін меристемалық аймаққа айналады немесе биполярлық глобулярлы проэмбрио / ұрық бастамасы / түзіледі де, одан эмбриоинды - ұрық тәрізді құрылым өсіп жетіледі. Дегенмен әрі қарай дамудың өзгешелігін полярлық / қарама-карсылық / 'белгілейді. Жасанды ортада өскен каллустар жасушалардың бөлінуі ретсіз, әрі әр түрлі бағыттарда жүреді де, ұлпалардың бытыраңқы массасы пайда болады, яғни каллустарда белгілі полярлық өсі жоқ. Ал, өскін-тамыр меристемаларының, жасушаларының бөлінуі қатаң түрде бір ретпен жүретіндігімен

іп vitro жағдайында өсіретін жасушалар өсімдіктер биотехнологиясында екі бағытта қолданылады: біріншісі- жасушалар массасы, яғни каллус; екіншісі- регенерант өсімдіктері. Сөйтіп, өсімдік жасушаларын жасанды қоректік ортада өсіргенде регенерация процессі негізгі іргелі процесс, себебі онсыз өсімдіктер биотехнологиясындағы көптеген салалары жүзеге аса алмайды.

Жасанды ортада регенерант өсімдігі пайда болу құбылысы дәлелденгендей, маманданған өсімдік жасушалары барлық генетикалық қасиеттерін сақтап қалады, яғни тотипотентті болады. Тәжірибе жүргізуде талай өсімдіктер түрінің жеке жасушаларының тотипотенттілігі анық көрсетілгенімен, зерттеушілерідің бәрі бірдей, тотипотенттілік қасиет өсімдіктің кез келген жасушаларына тән деп есептемейді. Оған мысал ретінде тотипотенттік қасиетін көрсетуі қиын объектілер мағынасында, көптеген өсімдіктердің жасыл жапырақ табақшасы жасушаларын, астыктұқымдастарда-оқшауланған протопласттарды келтіруге болады. Бұдан басқа қоректік ортада ұзақ уақыт өсірілген штаммдар да морфогенезге деген қабілетін жояды, астыктұқымдастар ұлпалары жасанды ортада өсіру кезеңінде сол қабілетін өте тез жоғалтады. Қоректік ортада ұзақ уақыт өсіру кезінде, ядролық және цитоплазмалық гендері қайта құрылған жасушалар популяциясы қалыптасып ,ал олар жасушалардың қайта дифференциялануына және морфогенезге өтуіне тиым салып, жол бермеуі мүмкін. Тәжірибе жүзіндегі морфогенездің, өз алдына қоятын мақсаты, ол дифференциялану және регенерация процестерін іп vitro жағдайында басқару мәселелері.

1. 
   Жасушалардың іп vitro жағдайында дифференциялануы морфогенезі
   
2. 
   Жасушалардың регенерациялану ерекшеліктері.
   
3. 
   Жасанды ортада регенерант өсімдігі пайда болу құбылысы.
   
4. 
   Органогенез
   

1. 
   Өсімдіктерді клоңдық микрокөбейту және оның артықшылығы
   
2. 
   Клондық микрокөбейтудің әдістері.
   
3. 
   Қолтық бүршіктердің меристемасының дамуын индумиялау
   
4. 
   Тікелей эксплант жасушаларынан косалқы өркендердің және мүшелердің түзлуі
   

1. 
   Стерильдік жағдайда қоректік ортаға отырғызылған әртүрлі маманданған ұлпалардың тірі жасушалары көбейуге қабілетті және қолайлы жағдай жасалса өзінің тотипотенттілігін толық жүзеге асырып, жаңа өсімдікке бастама бола алады. Жеке жасушалардың бастапқы өсімдіктердін барлық белгілері бар, тұтас организм жасауға қабілеті клондық көбейтуде табысты түрде пайдаланылуда.
   

Осы келтірілген артықшылықтарына байланысты клондық микрокөбейту әдісін өсімдік өсіруде және селекцияда мынандай мақсаттарға қол жеткізу үшін пайдалануға болады: 1/ ауыл шаруашылығы дақылдарының белгілі сорттарын тез және нәтижелі түрде көбейту; 2/ көбею коэффициенті төмен құнды екпе және жабайы ағаштар тұқымдары дәндері арқылы көбейгенде ұрпактары белгілері бойынша ажырап кететін, ал дағдылы әдістер мен вегетативтік түрде көбейюі өте жай немесе тіпті көбейтілін өсімдіктерді көбейту; 3/ гетерозистік будан тұқым өндірісі үшін линияларды нәтижелі түрде алу және көбейту; 4/ вирустардан және патогендік микроорганизмдерден тазартылған, шаруашылык әсемдік дақылдардан көшет материалды алу және оларды аурулардан сақтау; 5/ кұнды таңдаулы өсімдіктерден генетикалық жағынан бірдей ұрпақ алу мақсатында көбейту, мысалы, гаплоидтық өсімдіктерді, жасушалық және гендік инженерия әдістері арқылы кұрастырылған бірлі-жарым өсімдіктерді көбейту; 6/ көп мөлшерде жасанды тұқым алу. Жасанды тұқым деп, даму кезеңдері бірдей жасанды қабықшалармен қапталған, эмбриоидтарды атайды. Қабықшалар эмбриондарды қолайсыз жағдайлардан берік қорғайды және ұзақ уақыт аралығында тіршілік қабілетін сақтауын камтамасыз етеді. Әзірше бұндай "тұқымдарды" лаборатория жағдайында аз мөлшерде алып, тек ғылыми- зерттеу және селекциялык жұмыстарда қолдануда. Биотехнология бұл "тұқымдардың" өте көп мөлшерде алынуын қамтамасыз етуі керек.

2. Клондық микрокөбейтудің әдістері.

Клондық микрокөбейтудің әдістерінің бірнешеуі белгілі, оларды кейбір авторлар жасанды ортада өскен ұлпалардан морфогенетикалық процесстердің жүруіне байланысты жіктейді. Н.В.Катаева жөне Р.Г.Бутенко әдістерді жаңа түрде жіктеуді ұсынады, олардың басқалардан айырмашылығы, оның негізіне жасанды ортада бұрыннан бар және жаңадан бастама жасушалардан пайда болған өсімдіктер арасындағы айырмашылық алынған.

Бірінші типтегі өсімдіктер тұтас өсімдікте бұрыннан бар меристемаларды / сабақтың ұшы, қолтық және бұйыкқан бүршіктерін / активтендіру арқылы алынған. Меристемадан пайда болған бұл өсімдіктер генетикалық жағынан ата-аналық формаларымен бірдей, себебі меристемалар көпшілік жағдайда генетикалық тұрақтылығын сақтайды.

Өсімдіктердің екінші типі бүршіктер мен эмбриоидтардың пайда болуын индукциялау арқылы алынады. Маманданған және каллустық жасушалардан алынған бұл өсімдіктер, жасанды ортада генетикалық тұрақсыздығымен сипатталады және ата-аналық өсімдіктерден біраз өзгеше болуы мүмкін. Сөйтіп, бұл әдісті тек кейбір каллустары генетикалық тұрақтылығымен ерекшеленетін немесе регенераттар арасындағы ауыткушылық табиғи аутқушылық деңгейінен аспайтын өсімдіктерге қолдануға болады.

Бүршіктер мен эмбриоидтардың пайда болуы: 1/ тікелей экспланттың маманданған ұлпаларынан /репродуктивтік мүшелер ұлпаларынан, эпидермистен, субэпидермалық ұлпалардан, жапырақ қабыршағы мезофилліктен т.б. 2/ эксплант жасушаларынан түзілген бастапқы каллустан; 3/ басқа ортаға көшіріп отырғызылған кіштустан.

Енді нақтылы морфогенетикалық реакциялардың негізінде өсімдіктің пайда болуын қарастырамыз. .

3. Қолтық бүршіктердің меристемасының дамуын индумиялау

Қолтық бүршіктің өсуін активтендіру және қолтык, өркенін қолдану, өсімдіктерді вегетативтік жолмен көбейтудің ең кең таралған әдістерінің бірі. Тұтас өсімдіктерде қолтық бүршіктерінің өсуі апикалдық басымдылык арқылы тежеледі. Қолтық меристемаларының өсуін ынталандыру үшін, сабақтың үшын алып тастайды немесе қолтық бүршігін цитокининдермен өндейді.

Қоректік ортаға цитокининдерді енгізу жанама бүршіктердің жаңануына әсер етеді және сан жағынан өте көп қолтық өркендерінің дамуын ынталандырады. Қолтық бүршіктердің отырғызуға дайындайтын өсімдіктерге 10000 лк болатын жарық түсіреді, яғни ондай өсімдіктердің көпшілігіне ең қолайлы температура шамамен 25°С тең болады.

Сонымен, қолайлы жағдайлар толық жасалғаннан кейін, пайда болған каллус белсенді түрде бөліне бастайды да, бүршікке немесе эмбриондге бастама береді. Бүршіктен дамып жетілген, тамырланған өркен мсіі микрокалемшелеу жұмыстары жүргізілсе, онда ол көбейту коэффиииентін айтарлыктай арттырады. Өркендерді тамырландыру, ол тұтас өсімдік өсіріп алудың басты шарты.

Ұрық тәрізді құрылымдар - эмбриондар, бүршіктерге карағанда сабақ пен тамырдың апекстерінің бір мезгілде дамуын қамтамасыз етеді. Каллустық жасушалардың ұрық жасушаларына айналып, одан кейін олардан эмбриоидтардың түзілуі, фитогормондар арқылы реттелетін процесс. Егер, каллустардың маманданбаған жасушаларының эмбриондық жасушаларына айналуына ауксиндер кл-хт болса, ал эмбриондык жасушалардан эмбриоидтар түзілуі үшін фитогормондардың кажеті жоқ. Сондықтан, ауксин концентрациясы ортада толығымен немесе тіпті жоқ болуы керек. Дегенмен, бұл ережені де мүлдем шындық деп қабылдауға болмайды, себебі кейбір өсімдіктер түрлерінде сомалық эмбриогенезді индукциялау цитокининдер мен иббереллшідердің катысуы арқылы жүзеге асады. Сомалык эмбриогенез орхидея және цитрус тұқымдастарына жататын өсімдіктерді микрокөбейту үшін кеңінен колданылады.

Сөйтіп, каллустардан өсімдіктер өсірудің екі жолы да -эмбриоидтар пайда болуы және органогенезі - өте тиімді, кейбір жағдайларда өсімдіктерді микрокөбейтудің жалғыз мүмкін жолдары, мысалы, зәйтүн пальмасы үшін %

4. Тікелей эксплант жасушаларынан косалкы өркендердің және мүшелердің түзілуі экспланттарды жасанды ортада өсіргенде каллустық ұлпалар барлық уақытта бірдей түзілмейді. Кейбір жағдайларда бүршіктердің маманданған ұлпалардан тікелей пайда болғаны байқалады. Өсімдіктердің оқшауланған ұлпаларының жеке жасушалары корреляциялық қарым-қатынастың бұзылуынан дифференцияланып, меристемалық аймактар пайда болуы мүмкін, соларда кейіннен өркендік бүршіктер салына бастайды. іп vitro жағдайында осы қосыңқы бөлшектер эпидермистен, жапырақ қабыршағының мезофиллінен, субэпидермистен пайда болады. Қосалқы өркендерді тамырландырса, тұтас өсімдік алуға қол жеткізуге болады. Осы әдісті пайдаланып жасанды қоректік ортада өскен ұлпалардан бірқатар өсімдіктерді: шегіргүлді, фрезияны, пиязшықтарды т.б. көбейтіп алады. Қосалқы өркендердің жетілуі жанама және интерколярлық /мүшенің ортаңғы, буынаралык/ меристемалардың есебінен жүруі мүмкін. Шығу тегі меристемалық болуына байланысты, бұл өсімдіктер генетикалық жағынан ата - аналық формаларымен бірдей.

Эксплант ұлпаларында пайда болған меристемалық аймақтардағы жасушалардың дифференциалануы эмбриондар түзілуі жолымен жүруі мүмкін, бірақ ондай құбылысты өте сирек байқауға болады.

Соңында былай қорытынды жасауға болады, өсімдіктің тек бір түріне ғана емес, керек десе жеке ұлпалардың өзіне тән нақты морфогенетикалық реакциясын ескеріп, оны клондық микрокөбейту кезінде пайдалануға болады. Ақырында әдіс өсімдіктердегі болатын табиғи мутациялардан асып кетпейтіндей генетикалық тұрақтылықты қамтамасыз етуі керек.

Бақылау сұрақтары

1. 
   Өсімдіктерді клоңдық микрокөбейту және оның артықшылығы
   
2. 
   Колтык бүршіктердіц меристемасының дамуын индумиялау
   
3. 
   Тікслей эксплант жасушаларынан косалкы өркендердің және мүшелердің түзлуі
   
4. 
   Басқа ортаға көшіріп отырғызылған каллустан алу
   

Вируссыз тұқым шаруашылығы бірқатар сатылардан тұрады:

1. Картоп сортын сауықтыру. Осы мақсатпен апикальді меристема әдісі немесе оның термо немесе химиотерапиямен байланысы кең көлемде қолданылады.

2. Зертханалық және жылыжайларда сауықтырылған өсімдіктер мен түйнектердің жедел көбеюі.

3. Біріншілік және таңдаулы тұқым шаруашылығымен айналысатын маманданған шаруашылықтардың қажеттілігін қанағаттандыратын көлемде далалық жағдайдағы меристемалық клондардың бір-екі жылдық көбеюін біріккен клонды материалдардың зақымданғанын бақылау арқылы алу.

4. Жоспарланған көлемде картоптың супер-супертаңдаулы және таңдаулы түрлерін алғанға дейін өнімнің сапасын сақтауға және қайталанатын инфекциядан сақтауға бағытталған арнайы технологияны сақтау арқылы арнайы тұқым шаруашылығында сауықтырылған негізгі материалды көбейту.

Бірінші әдістемелік нұсқаулардың шыққан уақытынан бастап, ұштық меристема әдісін қолдану арқылы картоп сорттарын сауықтыру технологиясы біздің еліміздегі біріншілік-таңдаулы тұқым шаруашылығының негізгі бөлігі болды.

Осы уақыт аралығында бірқатар ғылыми-зерттеу мекемелері картоп сорттарын сауықтыру, сауықтырылған негізгі материал өндірісі және онымен картоптың тұқым шаруашылығын қамтамасыз ету жөнінде үлкен жұмыстар атқарылды.

Жеке элементтердің, сонымен қатар бүкіл технологияның жетілдірілген әдістемесі келтірілген. Бұл вируссыз негізгі материал алу өндірісін тиімді шешуге мүмкіндік береді.

Меристеманы түйіннің жасыл немесе этиолирленген өскіндерінен бөліп алады. Меристеманың жасыл өскіндерден түзілуі техникалық процесс, онда олар жақсы ажыратылады және түзілуі кезінде зақымдануға төзімдірек болады. Бірақ этиолирленген түйінді қолданғанда сауықтыру жұмыстарының эффективтілігі жоғары болады, себебі мұндай өскіндердегі вирустар концентрациясы айтарлықтай төмен, сондай-ақ вирусы жоқ ұштық меристема аумағы жарықта өсірілген өскіндердікінен әлде қайда көп болады. Түйіндер 2 см немесе одан үлкен болып өскеннен кейін оны бөліп алады.

Меристеманы өсіру жұмыстары сынапты-кварцті немесе БУВ типті бактериоцидті шамның көмегімен залалсыздандырылған микробиологиялық боксте жүргізіледі. Жұмысты бастар алдын жұмыс орнын (столды, бинокулярлы лупаны) және пробиркалары бар штативті спиртпен сүртеді. Өскіндермен жұмыс жасауға арналған құралдарды (пинцеттерді, скальпельдерді, инелерді) әрдайым қолданар алдында спиртке салып, содан соң от жалынына қару арқылы залалсыздандырып отырады.

Залалсыздандыру жұмысы сапалы болуы үшін КПГ-І типті ламинар-боксті немесе изотоптармен жұмыс жасау үшін арнайы жабдықталған плексиглазды бокс-камераларды қолданады. Өскіндерді меристеманы бөліп алар алдын 0,1% диацид ерітіндісінде залалсыздандырады (этанолмеркурхлорид пен ацетил пиридиний хлоридінің қоспасы). Диацид ерітіндісін бидистильденген суда даярлайды. Өскіндерді химиялық стаканға салып диацид ерітіндісін құяды да 3-5 мин залалсыздандырады, содан соң үш рет залалсыздандырылған сумен шаяды. Сондай-ақ 1-6% кальций гипохлоридінің ерітіндісімен немесе натрий не 0,1% сулема ерітіндісімен де залалсыздандыруға болады.

Дезинфекцияланған өскіндерді залалсыздандырылған Петри табақшаларына салып, солып қалмас үшін бірнеше тамшы автоклавталған су тамызады. Кескін кесіп алар алдын өскіннің ұшындағы ұштық жабын жапырақшасын алып тастайды. Бұл операцияны масштабты торы бар 24 есе үлкейтілген бинокулярлы микроскоптың астында дисцизионды медициналық иненің көмегімен жасаған дұрыс. Беттік жабындық қабаты (зачатков(примордий)) жоқ өлшемі 100-250 мк ұлпа кесіндісінен тұратын меристеманы цангалы ұстағышта қысылған кәдімгі жіңішке инемен бөліп алады. Сондай-ақ бұл үшін үшкірленген дисцизионды инені немесе циангалы ұстағышқа қысылған алмасты да қолдануға болады. Меристеманың ұшындағы да, жанындағы да өсу нүктелерін кесіп көруге болады. Беткі қабықшаны сылып алу мен меристеманы бөліп алу операцияларының әрқайсысын жеке-жеке залалсыздандырылған құралдармен жасайды. Кесіп алынған меристеманы иненің ұшымен пробиркадағы қоректік ортаның бетіне егеді. Сосын пробирканы жалынның үстінде тығынмен жауып, қайта штативке қояды. Барлығына егіп болғаннан соң штативті целлофан дорбамен ортаның кеуіп кетпеуі үшін жауып қояды. Қоректік ортаға егілген меристемасы бар пробирканы күнделікті жарық пен ылғал температуралық режимі бар арнайы камераға ауыстырады. Көбіне мұндай режимді сақтау үшін ауаны кондиционирлейтін қондырғысы бар люминесцентті шамдармен немесе меристема ұшынан өсімдіктерді өсіруге арналған арнайы жарықтық қондырғылармен (СУВР-Р, СВ-11 типті климаттық камералар) жабдықталған бөлмелерді қолданады. Бөлме температурасы РТ-2 және үш БК-1500 кондиционерінің көмегімен автоматты түрде реттеліп отыратын болса, онда көлемі 5×6 мбөлмеде бір мезгілде 6000 өсімдік өсіруге болады. Камераның температурасы 24-25⁰С, жарықталуы 6±2 мың лк., фотопериоды – 16 сағ., ылғалдылығы - 70%-ға жуық болады. Меристемадан өсімдіктің жақсы өсіп шығуы үшін ең маңыздысы бұл оларды бөліп алу мен тұрақты режимі бар камераға қою арасындағы периодты қысқарту. Меристеманы егіп, одан 5-6 жапырақты өсімдіктің өсіп шығуына кететін уақыт 30-45 күнді құрайды, бірақ кейбір меристемалар тіршілікке бейім бола тұра 2-8 айда өсімдікті регенерацияламайды.

Өсімдік толық өсіп шыққанға дейін меристемадан өсіп шыққан өскіндерді дәл сол ортаның жаңасына не құрамы басқа ортаға ауыстырып отырғызады.

Алынған 5-6 жапырақты өсімдікті бөліп, әр жапырақшаны өсімдік өсіп шығуы үшін қоректік ортасы бар пробиркаларға отырғызады. Сонымен, бір уақытта регенерант-өсімдіктерге электронды-микроскопиялық бақылау жүргізеді.

Препараттарды даярлағанда бірінші және одан кейінгі кескіндерді отырғызу барысында өсімдіктің төменгі бөлігінен жапырағы жақсы жетілген бір кескінді іріктеп алады. Нақты толық нәтижеге қол жеткізу үшін әрдайым 2-4 препараттан тізбектеп отырғызу кезінде кем дегенде үш рет диагностикалау қажет. Бақылау үшін иммуноферментті анализдің in vitro зақымданған өсімдігін қолданған кезде жақсы нәтижелер алынды (ELIZA-TEST). Вирусы бар регенерант-өсімдіктерді алып тастайды. Вирусы жоқ өсімдіктерді шартты белгілермен белгіленіп, in vitro кескіндеу арқылы көбейтеді.

1. 
   Вируссыз тұқымшаруашылығының сатылары?
   
2. 
   Микрокөбейту жұмыстары?
   

1. 
   Өсу коэффициентінің жоғарылығы. Бір гербари өсімдігінен дағдылы әдістерді қолдану арқылы жылына 50-100 өсімдік өсірілсе, ал ұлпаларды қоректік ортада көбейту арқылы 1 млн. өсімдік алуға болады; алманың бір жоғарғы бүршігінен 8 айдың ішінде 60 мың өскін алуға болады.
   
2. 
   Өсімдіктерді жыл бойы өсіруге болады:
   
3. 
   Әдіс өте тиімді және үнемді. іп vitro жағдайында кішірек лаборатория көлемінде мыңдаған өсімдік өсіруге болады.
   
4. 
   Өсімдіктерді көбейтумен қатар оларды вирустар мен патогендік микроорганизмдерден сауықтыру бірге жүретіндігі.
   
5. 
   Ұлпаларды іп vitro өсіру арқылы вегетативтік жолмен өте қиын немесе тіпті көбеймейтін өсімдіктерді, мысалы, пальманы көбейтуге болатындығы.
   

1. ауыл шаруашылығы дақылдарының белгілі сорттарын тез және нәтижелі түрде көбейту;

2. көбею коэффициенті төмен құнды екпе және жабайы ағаштар тұқымдары дәндері арқылы көбейгенде ұрпактары белгілері бойынша ажырап кететін, ал дағдылы әдістер мен вегетативтік түрде көбейюі өте жай немесе тіпті көбейтілін өсімдіктерді көбейту;

3. гетерозистік будан тұқым өндірісі үшін линияларды нәтижелі түрде алу және көбейту;

4. вирустардан және патогендік микроорганизмдерден тазартылған, шаруашылык әсемдік дақылдардан көшет материалды алу және оларды аурулардан сақтау;

5. кұнды таңдаулы өсімдіктерден генетикалық жағынан бірдей ұрпақ алу мақсатында көбейту, мысалы, гаплоидтық өсімдіктерді, жасушалық және гендік инженерия әдістері арқылы кұрастырылған бірлі-жарым өсімдіктерді көбейту;

6. көп мөлшерде жасанды тұқым алу. Жасанды тұқым деп, даму кезеңдері бірдей жасанды қабықшалармен қапталған, эмбриоидтарды атайды. Қабықшалар эмбриондарды қолайсыз жағдайлардан берік қорғайды және ұзақ уақыт аралығында тіршілік қабілетін сақтауын камтамасыз етеді. Әзірше бұндай "тұқымдарды" лаборатория жағдайында аз мөлшерде алып, тек ғылыми- зерттеу және селекциялык жұмыстарда қолдануда. Биотехнология бұл "тұқымдардың" өте көп мөлшерде алынуын қамтамасыз етуі керек.

іп vitro көбейтудің этаптары микрокөбейтудің барлық бастапқы

өсімдіктерді клондау арқылы процесстерін 4 кезеңге бөлуге болады.

Бірінші этап. Өсімдіктердің бастапқы ұлпаларының экспланттарын іп үІіго өсіру. Бұл кезеңде қоректік ортада инфекциядан таза ұлпаларды өсіріп, олардың тіршілігін сақтап, экспланттардың тез өсуіне қол жеткізу керек. Өсімдіктерді көбейтуде жетістікке жету, эксплантты дұрыс тандап алудан басталады, бұл кезде донорлық өсімдіктің өсу фазасы және өсу жағдайларын ескеру керек.

Екінші этап. Нактылы микрокөбейту кезеңі, яғни эксплантта бастама жасушалар /инициальдар/ санын көбейтіп, олардан өркендердің пайда болуына жағдай жасау.

Үшінші этап. Көбейтілген өркендерді тамырландыру және оларды сақтау. Бұл кезенде тамыр жүйесінің қалыпты өсуіне толык жағдай жасалады, қоректік ортаға тамыр пайда болуына жауапты фактор-ауксин косылады. Одан кейін өсімдіктерді топыраққа отырғызуға дайындау басталады немесе сақтау үшін төмен температура жағдайына ауыстырады. Онда өсімдіктің өсуі тежелінеді,темекі теңбіл кеселі вирусының концентрациясы өсімдіктің жоғарғы ұшына карай азая беретінін анықтады. Өсімдіктердің жартысында өркенінің жоғарғы ұшында немесе аппикальдық меристемаларында вирус табылмаған. Вегетативтік жолмен көбейетін дақылдарды вирустық аурулардан сауықтыру үшін, апикальдық меристемаларды өсіру әдісін колдану 1952 жылы Морель мен Мартин жұмыстары арқасында басталды. Олар бұл әдісті теңбіл кеселі вирусынан георгинді сауықтыру үшін пайдаланды.

Меристемалық ұлпаларда вирустардың көбею қабілеті төмен екендігі туралы біркелкі пікір жоқ. Меристемаларда вирустардың жоқ болуы, кейбір зерттеушілердің пікірі бойынша, өсімдіктің жоғарғы ұшының меристемасында өткізгіш жүйенің жоқ болуынан, ал гоазмодесмалар көлемі өте кіші немесе тіпті жоқтың қасы, сондықтан вирустардың жасушадан жасушаға ауысуы тежеледі. Басқа ғалымдар бұл фактіні вирус нуклео- протеинінің синтезін жүргізбейтін меристемалық жасушалардың ерекше метаболизмінен деп түсіндіреді. Жылумен өңдеу арқасында /34-40°С/ өсіп келе жатқан өркеннің ұшында вирустардың көбеюінің тежелуі жағдай, меристема дифференциланғанда вирустардан таза жасушалардың пайда болуы мүмкін. Вирустардан таза өркеннің өсіп шығуы үшін, донорлық өсімдіктерді /апикальдық меристема алынатын өсімдіктер/ өңдеуде табысқа қол жеткізу үшін, жоғары өсуіне жақсы жағдай жасап, 34-40°С температурада неғұрлым ұзақ ұстау керек.

Өсімдіктерді жылумен өңдеп оның меристемасын жасанды ортада өсіріп, міндетті түрде вирустарды тексеру қажет, ол үшін түрлі әдістер қолданылады. Оның біреуі - вирусты айқындаушы өсімдіктер - вируспен зақымданған өсімдіктен бөлінген шырынды тамызғанда, арнайы сезімталдық реакция арқылы жауап беретін өсімдіктер. Вирустарды анықтаудың электрондық микроскоптан әдісі өте жоғарғы дәлдік көрсететіні анық, бірақ бұл жол өте қымбат және көп еңбек сіңіруді қажет етеді, сондықтан сан жағынан көп мөлшерде өсімдіктерге бақылау жүргізу үшін күнделікті тәжірибеде қолдануы мүмкін емес. Вирустарды анықтауда сезімталдығы өте жоғары иммуноферменттік талдау болып табылады, ол " антиген-антидене " комплексінің ферменттік активтігін аныктауға негізделген. Бірақ ол үшін арнайы реактивтер жиынтығы қажет. Серологиялық әдіс арқылы вирустарды жылдам анықтау мен бірге ерекшелеуге болады. Дегенмен, бұл әдістің сезімталдығы орташа және барлық вирустарды анықтауға арналған сывороткалар жоқ.Егістік дакылдарды және жеміс-жидектерді, сәндік өсімдіктерді сауықтыру үшін жылумен өңдеуді және меристемаларды жасанды ортада өсіруді қатар қолданып, таза өсімдіктерді вирустарды анықтау арқылы іріктеп алу жұмыстары комплексті түрде жүргізілуі керек. Г. Лейке т.б. көрсетулері бойынша, тәжірибелерде қолдануға болатын, вирустардан тазартылған материал алуда табыска қол жеткізудің негізгі шарттары төменде көрсетілгендей.

І. Материалды жылумен өңдеу мүмкіндігі. 2. Меристемаларды жасанды қоректік орталарда өсіруге болатындығы. 3. Вирустарды аныктауға арналған жоғарғы дәлдігі бар тесттердің бар болуы. 4. Сауықтырылған өсімдіктің көбею коэффициентінің жоғары болуы. 5. Қайтадан вирустармен зақымдалмауы үшін, сауықтырылған бастапқы материалды толық оқшауланған жағдайда көбейтуді ұйымдастыру. 6. Бастапқы материалды жыл сайын алмастырып отыру үшін вирустардан тазартылған материалдың жеткілікті мөлшері қажет. Әртүрлі дақылдарда осы көрсетілген шарттардың орындалуы бірдей емес. Қазіргі уақытта осы әдісті қолдану аркылы шаруашылықтарда пайдаланып, сүрген картоптың барлық бағалы сорттары сауықтырылған және алдыңғы қатарлы елдерде тұқым шаруашылығы тәжірибесінде кең қолданылады.

Вирустардан тазартылған картоп өндіру технологиясы картоп түйнегінің термотерапиясынан басталады. Вирустардың тиюіне байланысты жылумен өңдеу 7 күннен 7 апта бойына жүруі мүмкін. Түйнектер сондай-ақ вирустарға қарсы ингабиторлары мен және түйнектердің өсуі үшін стимуляторлармен өңделеді. Меристемалардың ұсақ бөлшектерін алу үшін, ұзындығы 3-5 " болатын түссіз немесе сәл ғана жасыл өркендерді пайдалана зарарсыздандырылған бокстың ішінде сырттай зарарсыздантылған және жуылған негізгі өркендерді бірнеше бөлшектерге бөледі. Мөлшері 50-100 мкм меристемалауды оқшаулау тәжірибе жүзінде мүмкін емес, сондықтан меристемалармен бірге бүршіктегі бастапқы жапырақта оқшауланады, сондықтан оның мөлшері үлкейіп 500 мил жетеді, одан да үлкен болады. Осы мөлшерінің үлкен болуынан вирустардан таза экспланттар алу мүмкіндігі төмендейді, бірақ меристемалардың дифференциялану дәрежесі артады.

Агарланған қоректік ортаға отырғызылған аспек егер өсіп жетіледі де, кейін ұзындығы 0,3- 0,5 см өскіндер пайда болғанда оларды тамыр түзілуі және өсуді ынталандыру үшін, жаңа қоректік ортаға ауыстырып отырғызады 5-7 жапырағы шыққаннан кейін, бұл өсімдіктерді қалемшелейді, әрбір қалемшөп құрамы жағынан шығыңқы қоректік ортамен бірдей қоректік ортасы бар пробиркаларға отырғызады. Бір қалемше вирустардың бар-жоғын анықтау үшін пайдаланылады. Таза өсімдіктер картоптың вируссыз линияларын беретін негіз салушылар болады. Таза линияларды көбейтуді тездету үшін, жүйелі түрде қалемшелеу әдісін қолданады. Меристемаларға тарапында қалемшелерден өсімдіктердің өсіп жетілуі әжептеуір тез, тамыр жүйесі өте мықты және жапырағының саны да көп болады. Өсімдіктерді пробиркаларда қалемшелеу әдісін қолданып 2-3 ай ішінде 2-3 мың өсімдік өсіріп алуға болады.

Осы өте нәзік өсімдіктерді /супер-супер элита/ әрі қарай сақтауға қояды немесе теплицаға топыраққа отырғызады. Ескеретін жағдай, жұмыстың бұл кезеңі жауапты болғандықтан ұқыптылықты талап етеді. Л. Н. Трофимецтін қызметкерлерімен бірге анықтауы бойынша, колайлы жағдай жасалса сортты сауықтыру үшін орташа шамамен 40 апекстің меристемалары жеткілікті және 7-8 ай ішінде іп vitro жағдайында 30-40 мың түйнек алынады деп есептейді. Сауықтыру тиімділігі көбінесе сорттык ерекшелікке, вирустармен бастапқы зақымдануына, жыл мерзіміне т.б. жағдайларға тәуелді.

Оқшауланған жағдайда тештицада көбейтілген өсімдіктер суперэлита болады, одан кейін суперэлиталық тұқым алынатын орындарда көбейтіледі. Іріктеліп алынған таңдаулы өсімдіктер элита өндірістік питоминктерде көбейтіледі және олардан алынған түйнектер /тұқымдык материал/ өндірістік негізде өнім алу үшін шаруашылықтарға беріледі. Бірақ 5-6 жыл аралығында тұқым қайтадан вирустармен зақымданады, сондықтан, жаңадан сауықтырылған тұқымдық материал қажет болады. Соңғы кезде көбейту тиімділігін арттыру максатымен сауықтырылған өсімдіктерді микротүйнектер арқылы көбейту әдісі жүзеге асырылуда. Ол үшін қалемшелерді құрамы ерекше ортаға отырғызып, 10-15° С температуа,да ұстайды. Соның нәтижесінде 3-8 апта ішінде жапырақтар қолтығында көптеген бұршақтай микротүйнектер түзіледі. Оларды сақтау да оңай және топыраққа отырғызғанда шығыны болмайды.

Зерттеушілер картоп өсімдігін сақтау үшін, каллустық ұлшіны пайдалануға да тырысуда. Каллустарды қайталап жаңа коректік ортаға отырғызу кезінде каллус жасушалары вирустардан тазарады және табиғи немесе жасанды түрде индукцияланған морфогенез жүреді де, таза регенерант өсімдіктері шығады. Кейбір сорттар үшін каллусты коректік ортада өсіру әдісі, апикальдык, меристемаларды өсіргенге қарағанда тиімділігі жоғары екені анықталған (Сурет 9). микротүинек- микротүтіктер терді сактау 4^о С

9 Сурет. Картоп өсімдігін сауықтыру және микротүйнектер арқылы көбейту ұлпаларды қоректік ортада өсіріп фитонаюгендік инфекциялардан таза тұқымдык материал алудың әдісі бірқатар көкөністік, жеміс-жидектік және сәндік дақылдар үшін жете зерттеліп, әдістемелері жасалған. Меристемаларды мұздатып сақтау /сұйық азотта- 196"С температурада/, қаржы мен өндірістік орын, еңбекті үнемдей отырып бастапқы материалдың генетикалық тұрақтылығы сакталатын, инфекциялардан таза генофоид коллекциясын ұстауға мүмкіндік жасайды. Аурулардан таза тұқымдық материалдар қолданып, өсімдік шаруашылығының тиімділігін арттыруға болады. Тиімділіктің артуы болашақта өсімдіктерді сауықтырудың өндірістік биотехнологиясының негізін қалайтын болады.

Бақылау сұрақтары:

1. 
   Микрокөбейту әдістері?
   
2. 
   іп vitro көбейтудің этаптары микрокөбейтудің барлық бастапқы өсімдіктерді клондау арқылы процесстерін 4 кезеңге бөлуге болады.
   
3. 
   клондық микрокөбейту әдісін өсімдік өсіруде және селекцияда мынандай мақсаттарға
   

1. 
   Жаңа сорттар шығару
   
2. 
   Ұлпаларды қоректік ортада өсіру әдісін селекцияда колдану.
   

Гаплоидтық өсімдіктер алу үшін жасушаларды өсіру әдісінің мүмкіндігі өте зор. Генетикалық базисті кеңейтудің жаңа мүмкіндіктері, мутацияларды іп vitro туғызып және жасуша деңгейінде сұрыптау жүргенде ашылады, ал оның бәрі тек жасушаларды жасанды ортада өсіргенде ғана жүзеге асырылады. Құнды белгілері бар, жекеленген бірден-бір регенерант өсімдіктерді тиімді түрде микроклондау әдісі арқылы көбейтуге болады.

Генетикалық жағынан бірдей регенерант өсімдіктерді негізінен бастағанда каллус арқылы алады. Каллустарды бірнеше рет қайталап жаңа қоректік ортаға отырғызып өсіру каллустық ұлпаларда цитогенетикалык, ортаның пайда болуына әсер етеді. Бұндай каллустардан орта регенерант өсімдіктер бастапқы өсімдіктен айтарлықтай өзгеше болады. Бұл кұбылыс өсімдіктердің жаңа формаларын шығару үшін қолданылады, ондай өсімдіктер сомаклондық варианттар деп аталады, олар да өсімдіктер селекциясы үшін генофондыны байытады.

Тікелей ДНҚ -ы деңгейіне генетикалык әрекет жасау инженерияның зерттеу бағыты генетикалық информацияларды жүргізу негізінде жаңа өсімдіктер формаларын шығаруға жол ашады.

Сөйтіп, жасушаларды өсіру әдісінің мүмкіндіктері соншалық зор болғандықтан, оның селекцияға жасайтын ықпалы арқасында адамзат келесі " жасыл революциясына " қол жеткізе алады.

Өсімдіктерді генетикалык жағынан жақсартудың биотехнологиялық әдістері;

1. Дағдылы және жаңа әдістерді байланыстыру

2. Жасушалық инженерия

3. Генетикалық . инженерия

4. Генетикалық базисті кеңейту.

5. Селекциялық процессті тездету.

6. Негізгі жаңа формаларды құрастыру.

Барлық дүние жүзі бойынша маңызды азық-түліктік дақылдарының генофондының кедейлену процессі күшеюде. Көптеген дамыған мемлекеттердің егістік алқаптарының саны аз, генетикалык жағынан гомогенді суперсорттар алып жатыр. Бұндай жағдайда модель түрлердің генофонды толықтыру мәселесін шешетін әріден будандастыру әдісінің маңызы артады. Сонымен бірге, әріден будандастырудың мүмкіндігі програмдық және гюстгамдық генетикалық сәйкессіздендіру әсерінен қолданылмайды. Програмдық сәйкессіздік деп, будандастыруға алынған парлар арасында ұрықтану процесінің жүрмеуін атайды, оның физиологиялык себебі, тозаңның пісіп жетілетін уақытының сәйкес келмеуі, тозаң өсуге қабілеті болмауынан немесе тозаң түтігінің өсуінің тоқтап қалуынан және морфологиялык, себебі / тозаң түтігінің қыска болуы т.б. /,тозаң ұрық қалтасына жетпейді, аналық гаметаның жұмыртқа жасушасымен косылуының мүмкін еместігінен. Парлардың генетикалық сәйкессіздігі де болуы мүмкін, ол барлық деңгейлерде байқалады: аналықаузы және мойны, тұқым бүршігі.

Постгамдық сәйкессіздік ұрықтанудан кейін байқалады, ол будан ұрықпен оны қоршап тұрған ұлпалардың генетикалық сәйкессіздігі, оны ұрық дамуының барлық кезеңдерінде байқауға болады. Түраралык будандастыру кезінде қосарлана ұрықтану процесінің жай жүретіні спермийлердің ажырамауы, дара ұрыктану фактілері жиі байқалады. Үш ядроның бірдей қосылуы /спермийдің және екі полярлық ядролардың косылуы/ болмаған жағдайда эндосперм қалыптаспайды, тіпті олардың косылуы жүргеннің өзінде эндосперм жай қалыптасады. Эндосперм дамып келе жатқан ұрыққа қоректену және реттелу факторларының көзі екені белгілі. Ұрықтың дамып жетілу жылдамдығы әр уақытта бір калыпты емес, жылдамдығының төмендегенін ұрық дифференцияланған кезде байкауға болады.

Бұл ұрықтың азғындауына және өлуіне әкеліп соғады, онымен бірге әр түрлі аномалиялар пайда болады, қорытындысында сапасы жок жетілмеген ұрығы бар тұқым калыптасады.

1. 
   Өсімдіктерді генетикалык жағынан жақсартудың биотехнологиялық әдістері.
   
2. 
   Гаплоидтық өсімдіктер алу үшін жасушаларды өсіру әдістері.
   
3. 
   Постгамдық сәйкессіздік ұрықтанудың жеңу жолдары.
   

1. 
   Оқшауланған ұрықты коректік ортада өсіру
   
2. 
   іп vitro жағдайында ұрықтануды өткізу
   

Тіршілікке кабілеті жоқ түраралық және туысаралык будандар ұрығын өліп қалудан сақтап, оны жасанды қоректік ортада өсіру, біртіндеп постгамдық сәйкессіздікті жеңу үшін таптырмайтын әдіске айналуда. Осы әдісті қолдану негізінде көптеген түраралық / томат, асқабақ, құрма, зәйтүн, шие мен алша т.б. / және туысаралық / арпа мен бидай, диплоидтык және тетраплоидтық күріш, арпа, кара бидай т.б. / будандар алынды. Жетілмеген, оқшауланған ұрықтарды іп vitro жағдайында ойдағыдай өсіру бірнеше факторға, алдымен ұрыктың жетілу сатысына, одан кейін оның дифференциялану дәрежесіне байланысты. Оқшауланған дифференцияланбаған ұрықтарды өсірудің қиындығы, іп vitro жағдайында эндоспермнің гормондық ролін тура қайталаудың мүмкін еместігіне негізделген. Ұрық пен эндосперм арасында тығыз функционалды байланыс, әсіресе ұрықтың дамуының / эмбриогенез / ерте кезеңде бар екендігі ұрықтарды жасанды қоректік ортада өсіргенде нақтылы түрде белілі болады. Жас және жетілген эндоспермдердің гормондык комплекстері кұрамы жағынан өзгеше жас эндосперм ұрықтың дифференциялануын ынталандырса, жетілген эндосперм бұл процессті тежейді. Сондыктан, жетілмеген ұрықтар жетілгендермен салыстырғанда қореқтік орта құрамына өте жоғары талап қояды, олардың өсуі үшін қоректік орта құрамына физиологиялық активті заттар, сонымен қатар жас эндоспермдерден бөлінген экстракт, кокос сүті қосылады.

Т.Б.Батыгина және В.Е.Васильева әр түрлі пион ұрыгын табиғи және жасанды ортада өсіріп, эмбриогенез барысында маңызды кезеңді анықтады, ол кезең ұрық дамуының дербестілігі. Осы кезеңнен бастап ұрық аналық организмнен тәуелсіз болады, әрі қарай эмбриогенез процесін өтіп шығуға және қалыпты өркен беруге қабілеіті. Өсімдіктердің әр түрінің ұрығының тәуелсіз болу фазасын анықтаудың маңызы үлкен, себебі, осы уақыттан бастап ұрық өз бетінше қарапайым құрамында гормондар жоқ ортада өсіп жетіле алады. Пион өсімдігі ұрықтары үшін тәуелсіздік ұрық дамуының өте ерте жүрек тәрізді фазасында, ягни тұқым жарнағы дифференцациялана бастаған кезінде басталады.

Жетілмеген окшауланған ұрыктарды өсіруде табыска жету үшін, құрамы лайықты қоректік орта қажет, бұл орта ұрықтың қалыптасуын аяқтауға және өсе бастауына мүмкіндік жасайтын болу керек. Ұрыктарды өсіруге арналған әмбебап коректік орта жоқ, сондықтан орта құрамын іріктеу және үйлесімділігін келтіру, ұрыкты өсіру жұмыстарының негізгі мәселелері. Өсімдіктердің кейбір түрлері ұрықтарының дамуына азоттың органикалык, тұздары және калийдің жоғары концентрациясы, сұйық қоректік орта т.б. факторлар жақсы әсер еткен. Ұрықтарды жасанды ортада өсіргенде каллус түзілуі жиі кездеседі. Одан кейін, каллустың органогенезге өтуін индукциялап регенерант өсімдіктерді алуға болады. Каллусогенез және оның морфогенетикалық потенциалы көптеген факторларға байланысты. Ол факторлар: генотип, үрықгың дифференциялану дәрежесі, қоректік орта т.б.

КазМҰУ өсімдіктер физиологиясы және биохимия кафедрасында арпа және бидай ұрықтарын жасанды қоректік ортада өсіру жұмыстары табысты түрде жүргізілген. Арпаның әр түрлі экспланттарынан жетілген ұрықтан, жетілген ұрықтың бөліктерінен, гүлшоғырынан, жетілмеген ұрықтан каллус ұлпалары алынды. Анықталғандай, каллус ұлпаларының морфогенетикалық қабілеті бастапқы экспланттың типіне байланысты болып шықты. Жас гүлшоғыры және жетілмеген ұрықтар ұлпаларының регенерацияға ең жоғары қабілеттілігі бар. Морфологиялық және анатомиялық құрылысы сонымен қатар морфогенетикалық қабілеті бойынша өзгеше 10 түрлі ұлпалар типі бар екені аныкталды. Зерттеулер нәтижесінде, эмбриогендік линиялардың пайда болу жиілігі қоректік ортадағы 2,4 -Д концентрациясына байланысты екені анықталды. 2,4 -Д- ның жоғары концентрациясында жарты жыл бойы эмбриоидтар түзуге қабілетін сақтайтын линия алынды.

Жұмсақ бидай / Тrіtісиm аеstіvиm / және қатты бидайдың / Тrіtісиm durum / 14 сортының жетілу дәрежесі әр түрлі ұрықтары бөлініп, оларда каллус түзілу және морфогенез процесстері зерттелген. Каллус түзілудің қарқындылығы жоғары болды / 89- 100% /. Каллус ұлпаларының гемморизогенезге қабілеттілігі бірнеше факторларға байланысты, олар генотип, қоректік ортаның құрамы, экспланттың физиологиялық жағдайы және оның қоректік ортаға бағытталуы. Тұтас өсімдік беруге, қатты бидай сорттарымен салыстырғанда жұмсақ бидай сорттары және жетілмеген ұрықтарынан пайда болған каллус ұлпалары, толық дифференцияланған ұрықтардан алынған ұлпаларға қарағанда өте жоғары қабілеттілік көрсетті. Қоректік орталардың ішінде регенерацияға Гамборг В₃ және Уайт орталарына қарағанда Мурасиге және Скуг ортасы өте қолайлы екендігі анықталды.

Бидайдың Саратовская 42 сортының жетілмеггн ұрыктарын қоректік ортаға дән жарнағын жоғары қаратып отырғызғанда пайда болган каллус ұлпаларының 70% астамы гемморизогенезге, яғни өркен жөне тамыр түзуге қабілеттілік көрсетті. Бидайдың екі сорты Целинная 21 және Саратовская 42 регенеранттарының тұқымы алынды.

Дамуының өте ерте кезеіңде тұрған ұрықтардан өсімдік алудың тағы бір әдісі, ол тұқым бүршікті және түйінді іn vitro жағдайында өсіру. Мұндай жағдайда өсіп келе жатқан ұрықтарды оқшаулаған кезде оның механикалық зақымдалуы мүлдем болмайды және объектілерді зигота кезеңінен емес, одан әлде қайда ерте, жетілген ұрық қалтасы кезеңінен бастап қоректік ортада өсіруге болады.

Дегенмен, көптеген эндоспермі жоқ өсімдіктердің тұқым бүршіктерінен тіршілікке икемді дәндерді алу өте қиын. Егер тұқым бүршікті оқшаулаған кезде орталық жасушада эндосперм ядролары өте аз болса да in vitro жағдайында тұқымбүршіктің эмбриогенезі қалыпты түрде жүреді. Тек кейбір есімдіктерде /шие, алша/ эндосперм атқаратын қызметін тұқымбүршіктің басқа ұлпалары атқара алады, сондықтан ұрық эндосперм болмағанның өзіңде де, зиготадан дифференцияланып өседі.

Тұқымбүршікті түйінмен бірге, тіпті зигота кезенінде оқшауланғанның өзінде эмбриогенез қалыпты жағдайда жүреді, себебі іп vitro жағдайында плацентадан келетін морфогенетикалық фактордың әсерінен эндосперм түзіледі. Бұл жерде мына жағдайды атап өту керек, эмбриогенез кезіндегі көптеген гормондық және ұлпа аралық әрекеттесулер жөнінде қрщы деректері, оқшауланған жетілу дәрежелері әртүрлі ұрықтарды, тұқымбүршіктерді, түйіндерді іп vitro өсіру арқылы анықталды. Оқшауланған ұрықты жасанды ортада өсіру эмбриогенездің бірқатар теориялық мәселелерін шешуден басқа тәжірибелік селекцияның маңызды бағыттарының қатарына қосылды. Әріден будандастыру кезіндегі ұрықтардың тіршілікке икемділігі болмауын жеңуден басқа ұрыкты өсіруді селекция процессін тездетуде қолдануға болады. Мысалы, тұқымның тынымдық кезеңін тоқтату өсімдіктердің көбею циклін қысқарту, дәндердегі өздігінен болатын стерильдігін жеңу, тұқымның өнгіштігін тез арада анықтау.

Тозаңды, тұқымбүршікті және түйінді іп vitro өсіру әдістерінің жетілуінің аркасында, тозаңмен бірге ұрықтанбаған тұқымбүршікті қатар өсіріп прогамдық сәйкессіздікті жеңуге мүмкіндік туды. Осылай тіршілікке икемді томаттың, темекіннің, үрме бұршақтың кауынның, қиярдың» кұлпынайдың дәңдері алынған. Гүлдердің ашылуына бірнеше күн қалғанда айқас тозаңданатыңдардың және өздігінен тозаңданатындардың да гүл кауызын кесіп алады да, зарарсыздандырады, олардың аналығын немесе түйінін, не болмаса тұқым бүршікті бүрбүршікпен бірге бөліп алып, коректік ортаға отырғызады. Қоректік ортаға отырғызардың алдында түйіннің кабығын кесіп, тұқымбүршікті ашады. Қоректік ортаға отырғызғаннан кейін 2-3 күн өткен соң тұқымбүршіктің жанына агары бар ортаға зарарсыздаңдырылған тозаңды отырғызады, тозаң өсе бастайды да, тұкымбүршіктің тозаңтесігі арқылы ұрық қалтасына түседі. Пробиркада ұрықганған ұрықтың дамып жетілуі бір қалыпты өтеді. Бұл істің орындалуын жеңілдетуге болады, ол үшін тұқым бүршікке тозаңды түсіріп, тозандаңған тұқым бүршікті жасанды ортада өсіреді. Өсімдіктердің іп vitro жағдайында тозандануы көкнәр, калампыр, алка тұқымдастарында /темекі, петуния/ жақсы жүредІ, себебі олардың түйінінде сан жағынан өте көп тұқымбүршіктері бар және оларды жасанды ортада өсіру жақсы жолға қойылған. Азық-түлік дақылдары үшін, гулдің мүшелерін және ұрықты жасанды ортада өсіруді катар жүргізіп, өсіру әдістерін әрі карай жетілдіріп, ол дақылдармен жүргізілетін селекция жұмыстарының тиімділігін арттыруға болады.

1. 
   іп vitro жағдайында ұрықтануды өткізу.
   
2. 
   Каллус ұлпаларының гемморизогенезге қабілеттілігі.
   
3. 
   Оқшауланған дифференцияланбаған ұрықтарды өсірудің қиындығы.
   

1. 
   Гаплоидтар жәнс олардың селекциядағы маңызы
   
2. 
   Тозаңқапты және тозаңдарды қоректік ортада өсіріп гаплоидтар алу
   
3. 
   Будан ұрыкта хромосомалардыц селективті жойылуы әдісімен гаплоидтарды алу
   

1. 
   Сомалық жасушалар ядроларында сыңар хромосомалар жиынтығы / п /, яғни түрдің өзіне тән хромосомаларының толық жиынтығының / 2п / жартысы бар организм гаплоид деп аталады.
   

Селекцияның дағдылы әдістері арқылы гаплоидтарды тәжірибеде алу жолдары /тұраралық және туысаралық тозаңдандыру, рентген сөулесімен өсер ету т.б./ тиімсіз және уақытты көп талап етеді. Жаңа әдістерді қолданып, мысалы, аталық гаметофитті / тозаңды / және аналық гаметофитті / ұрық қалтасы / іп vitro өсіру гаплоидтарды алуды бірнеше рет тездетеді және селекция процессін жеңілдетеді (10 сурет).

2. Бірінші С.Гуха және С.Махешвари 1964 жылы Индияда меңдуана тозаңқаптарын қоректік ортада өсіріп, гаплоидтық өсімдіктерді алғашқы рет алған. Одан кейін, бұл тәжірибелерді темекі өсімдігімен Францияда К.Нич 1967 жылы қайталап жасады. Сол уақыттан бері осы әдіспен 200-ден астам түрден гаплоидтық өсімдіктер алынды, соның ішінде: арпа, сұлы, күріш, картоп, рапс т.б. бар. Тозаңқаптарды жасанды ортада өсіру арқылы алынған гаплоидтар аталық гаметаның генотипін ұстайды, бұл процесс андрогенез деп аталады, бұл терминді кейбір ғалымдар келіспейді деп есептейді. Андрогенез тікелей және жанама жолмен өтуі мүмкін. /11 сурет/. Тікелей андрогенез тозаңдық эмбриогенездің аркасында, яғни микроспоралардың бөліну жолымен түзілетін эмбриоидтардан гаплоидтық өсімдіктердің пайда болуы. Гаплоидтық өсімдіктердің микроспоралардың дедифференциялануы нәтижесінде түзілетін каллустардан пайда болуы жанама андрогенез деп аталады.

Каллустан қоректік ортада алынған өсімдіктердің бәрі бірдей гаплоидтық бола бермейді. Сондықтан гаплоидтарды сансыз мөлшерде алу үшін, тозаңдық эмбриогенезді индукциялауға тырысады.

Тұтас тозаңқаптарды қоректік ортада өсіргенде каллус жасушаларының диплоидтық спорогенді тозаңқап жасушаларынан пайда болуы мүмкін екендігін атап өту керек. Осындай каллустардан өскен өсімдіктер диплоидтық немесе полиплоидтық болады. Сонымен қоректік ортада өскен тозаңдар жасушаларында мынадай процесстер журуі мүмкін:

1/ эмбриоидогенез;

2/ дедифференциялану және каллусогенез;

3/ шар тәрізді формалары бар құрылымдар пайда болады;

4/ микроспорогенез және гаметогенез жалғасады;

5/ микроспоралар кері кетеді.

Регенерант өсімдіктер, соның ішінде гаплоидтық өсімдіктер алғашқы екі процесстің арқасында алынған.

іп vitro жағдайында аталық гаметофиттен гаилоидтық спорофиттің пайда болуы өте күрделі және аз зерттелген процесс. Микроспоралардың даму жолдары өте күрделі, бастапқыда проэмбрио, одан кейін эмбриоид пайда болады. Бұл процесстің қалай басталатыны және реттелетіні белгісіз. Н.Сандерленд қызметкерлерімен бірге мендуананың оқшауланған микроспораларын қоректік ортада өсіріп, оның дамуының бастапқы кезеңдерін зерттеп, микроспоралардың қалыпты жағдайда дамуы өзгеше болатынын анықтады.

Микроспоралардың қалыпты in vivo дамуы келесі кезеңдерден тұрады:

1/ екі мейоздың қорытындысында тозаңның аналық жасушасынан микроспоралардың тетрадасы пайда болады

2/ қалыңдаған тетрада кабығынан микросиоралардың босануы;

3/ микроспора дамиды, екі митоз нәтижесінде жетілген тозаң пайда болады.

Iп vitro жағдайда тозаңның қалыпты дамудан ауытқуы микроспораның дамуының кез-келген кезеңінде жүруі мүмкін.

Тозаңқапты қоректік ортада өсіргенде екі вегетативтік ядросы бар микроспора /дамудың В жолы / пайда болуы мүмкін, немесе вегетативтік ядро генеративтік ядромен кұйылып қосылады, диплоидтық жасуша түзіледі /дамудың С жолы/. Осындай микроспоралар бөлінгенде пайда болатын проэмбрионың өз ерекшіліктері болады. Әр түрлі эмбриондар іп vitro жағдайында вегетативтік және генеративтік жасушалары бар қалыпты микроспораның пайда болуы мүмкін /дамудың А типі/, өйткені, олардың түзілуіне вегетативтік немесе генеративтік жасуша не болмаса екі жасуша да катыса алады. Екі жасуша қатысқан жағдайда диплоидтық эмбрионд жетіледі . Бұдан басқа даму кезеңінде аномалиялары болған / мейоздың бұзылуы / редукцияланбаған микроспорадан, сонымен қатар эмбриогенездің әр түрлі кезеңдерінде жүрген эндополиплоидия негізінде диплоидтар түзілуі мүмкін. Сөйтіп, проэмбрио түзілуінің әр түрлі цитологиялық жолдары бар және микроспораның даму бағыты көптеген факторлардың қатысуымен анықталады, соның ішінде олардың табиғи полиморфизмімен. Полиморфизм себептері мынада: даму кезіндегі аномалиялар, споралардағы бөліну шүйкесінің орналасуы т. б. Тозаңқапта болатын мыңдаған микроспораның тек бірен-саранынан ғана эмбриоид жетіледі. Эмбриоидогенезге қабілеттілік генетикалық негізделген болуы мүмкін. Стресстік ықпал мысалы, төмен және жоғары температура, иондалған сәулелермен әсер еткенде эмбриогендік микроспорапар санының артатыны тәжірибе жүзінде аныкталған. Тікелей андрогенезге өту үшін, донорлык өсімдіктің физиологиялық жағдайы, тозаңкапты жасанды ортаға отырғызу уақытындағы тозаңның даму кезеңі, қоректік орта кұрамы және жасанды ортада өсіру жағдайларының маңызы өте жоғары. Көптеген өсімдіктер үшін эмбриоид пайда болуда ең қолайлысы микроспораның бір ядролық кезеңі.

Фитогормондардың әсері микроспораның өсу кезеңіне байланысты болады. Мысалы, мейоз кезеңінде. фитогормондардың жоғары концентрациялары каллусогенезді күшейтеді, тетрада кезеңінде микроспораның калыптасуын және бірнеше митоздың өтуін, бір ядролық микроспора кезеңінде эмбриоидогенезді арттырады. Бұл жерде қоректік орта кұрамы туралы қалыптасқан пікір жок. Өсімдіктердің кейбір түрлері_; мысалы, астық тұқымдастар сахарозаның жоғары концентрациясын талап етсе /12%-ке дейін/, басқа түрлері күрделі органикалық қосындыларды /казеин гидролизаты/, ашытқы экстракты солод және картоп экстрактылары, кокос сүті/, үшіншілері- темір иондарының белгілі бір ара қатынасын. Эмбриоидтар түзілуін индукциялау үшін қазіргі уакытта алдын-ала гүл кауызын төмен /3-5°С/ және жоғары /ЗО-35°С/ температураларымен өңдеуді кеңінен қолданады. Одан кейін крестгүлділер тозаңқаптарын қоректік ортада 3О°С температурада өсіргенде гаплоидтардың шығуы артқан. Эмбриоидтардан тұтас өсімдік өсіру үшін қоректік орта құрамы да өзгеше болады.

КазМҰУ-ның өсімдіктер физиологиясы және биохимия кафедрасында бидай мен арпа тозаңкаптарын өсіру жұмыстары табысты жүргізілген. Кейбір генотиптер үшін, тозаңқаптарды жасанды ортада өсіргенде, тура және жанама андрогенез алу жолдарын белгілейтін қоректік орта және өсіру жағдайлары іріктеліп алынған, олардың цитоэмбриологаясы зерттелген. Гаплоидтық регенерант өсімдіктер алынды.

Тұтас тозаңқаптарды жасанды ортада өсіргенде сомалық ұлпалардан плоидтылығы әр түрлі өсімдіктер пайда болуы мүмкін, сондықтан оқшауланған гүл тозаңын өсірудің болашағы зор. Бұдан баска, тозаңды ортада өсіргенде тозаңқап ұлпаларында бар, өсуді тежейтін заттардың әсері төмендейді. Тозаңдарды, тозаңқапты кесіп шығарып алады, не болмаса оларды сұйық қоректік ортада өсіреді, бұндай көзде тозаң түйіршіктері өзінен өзі тозаңкаптан ортаға төгіледі. Тозаңқаптары үлкен, тозаң түйірлері ірі және еркін орналасқан өсімдіктер тозаңы механикалық жолмен бөлінеді, мысалы, сасық меңдуана тозаңқаптарын қоректік ортада өсіргенде өнімді мол беретін түр. Көптеген өсімдіктерге, соның ішінде астық тұқымдастарға, бұл әдіс жарамайды, олар үшін қалқыған тозаңқаптар әдісі тиімді. Сонымен қатар бұл кезде тозаңқаптардан жуылып шығатын биологиялық активті заттар есебінен ортаның кұрамы байытылады. Микроспораларды сұйық қоректік ортада өсіргенде тек эмбриоидтар пайда болады, олардан жасыл өсімдіктер өсіп жетіледі. Тозаңдарды қоректік ортада өсіріп алынған регенерант өсімдіктердің ішінде альбиностардың көп болатынын атап өту керек. Олар тозаңның дамуы кезінде болатын бұзылу негізінде пайда болады. Сонымен іп vitro андрогенді гаплоидтар алудың көптеген қиындықтары бар, өйткені бұл мәселенің теориялық зерттелуі жетерліктей деңгейде емес. Біз микроспораның әр түрлі даму кезеңінде морфофизиологиялык процесстердің ішкі және сыртқы факторлармен реттелуінің қалай жүретінін, микроспоралардың тотипотенттілігін іске асыру үшін қандай жағдайлар қажет екендігін тағы сол сияқты сұрақтарға жауабын білмейміз.

Сонымен бірге, қытай зерттеушілерінің бірқатар ауыл шаруашылық дақылдарынан көп мөлшерде гаплоидтық өсімдіктер алуда қол жеткізген табыстарын атау керек. Генотипті, тозаңның даму кезеңін, коректік орта құрамын үйлестіруді, өсіру жағдайларын, микротамшыдағы тозаң тығыздылығын іріктеп алу т.б. ескеріп, олар андрогендік гаплоидтар негізінде күріштің құнды бірнеше сортын, бидайдың, жүгерінің, кара бидайдың, арпаның, темекінің, мақтаның, сояның, тұқымдық капустаның, каучук беретін өсімдіктердің, бұрыш т.б. дақылдар сорттарын шығарды.

3. Арпаның диплоидтық мәдени Hordeum vulgare түрін көп жылдық жабайы пиязшық Hordeum bulbosum түрімен будандастырғанда Hordeum vulgare хромосомалары жиынтығы бар моногаплоидтар шығады. Ұрықтың және эндоспермнің өсуінің бастапқы кезеңінде жабайы түр хромосомалары ұрықтанғаннан кейін 5 күн өткен соң селективті /іріктелген/ жойыла бастайды, яғни элиминациясы басталады. Сөйтіп, Hordeum vulgare хромосомалары толығымен жойылып кетеді, бірақ 15 күннен кейін будан ұрықтың дамуы тоқтап қалады. Оны іп vitro жағдайында өсіріп, будан өсімдікті шығаруға болады.

Тозаңдануға алынған өсімдіктерден будандастырудың екі жағдайында, Hordeum bulbosum аналық және аталық форма ретінде алынғанда да гаплоидтар шығады. Бірінші жағдайда мәдени түрдің жұмыртқа жасушасынан түзілген, яғни аналық белгілері бар гаплоидтар алынады, ал екінші жағдайда мәдени арпаның андрогендік, яғни аталық белгілері бар гаплоидтар пайда болады. Осы әдісті қолданып және будан ұрықтарды іп vitro өсіріп, Одессадағы селекция және генетика институтында дағдылы селекция жұмыстарын жүргізіп жаңа сорт алуға кететін 10-12 жылдың орнына, 4 жылдың ішінде жаздық арпаның жаңа сорттары Исток пен Одесская-115 шығарылған. Канада да осы әдіспен арпаның Минго және Родео сорттары шығарылған. Тозандандырғыш ретінде пайдаланылғанда жабайы арпа бидайда да мысалы, Чайниз Спринг сортында гаплоидтарды алуға жол ашады. Хромосомалардың селективті элиминациясы мен кейін ұрықтарды жасанды ортада өсіруді бірге жүргізгенде, диплоидтық арпадан /2п=14/ тек қана моногаплоидтарды /п=7/ алып қоймай, тетраплоидтық арпадан /2п=28/ дигаплоидтарды /2п=14/ алуға болады. Гаплоидтар ұрықсыз болғандыктан, фертильді өсімдіктер алу үшін, гаплоидтарды міндетті түрде диплойдтық күйге айналдыру керек. Гаплоидтық организмнен алынған дигаплоид өте ерекше гомозигота, таза линия болады.

Пиязшық арпаны будандастыруға пайдаланып және хромосомалар санын екі еселеп, гомозиготалар алуға керек уақытты бірден қыскартады, бұл өте маңызды, өйткені организм гаплоидтық форма күйінде тіршілік ету кезінде рецессивтік гендерден тазарады. Гаплоидтар мутациялық селекция үшін де өте құнды, себебі гаплоидтық деңгейде генетикалық өзгерулерді анықтау жеңіл болады. Хромосомаларды екі еселеу үшін күздік лапыздың алкалоиды-колцихин қолданылады, бірақ ол химиялық мутаген, сондықтан диплоидтану табиғи түрде жүретін болса тіпті жақсы болар еді. Жасушаларды іп vitro өсіру оған қол жеткізудің бірден-бір жолы.

Бақылау сұрақтары:

1. 
   Микроспоралардың қалыпты in vivo дамуының кезеңдері.
   
2. 
   Қоректік ортада өскен тозаңдар жасушаларының процестері.
   
3. 
   Тозаңдарды қоректік ортада өсіріп гаплоидтар алу жолдары.
   

1. 
   Аналык гаметафитті өсіріп гаплоидтык өсімдіктерді алу әдісі
   
2. 
   Мутагенез және іп vitro жағдайындағы жасушалық селекция
   

1. 
   Гаплоидтық хромосомалар жиынтығы микроспорадан басқа тұқым бүршіктің генеративтік жасушасында, яғни жұмыртка жасушасында бар. Тұқым бүршігін өсіріп, гаплоидтық өсімдіктер алу гиногенез деп аталады, бұл апомиксистің /жыныссыз жолмен көбею/ бір түрі.
   

Француз ғалымы Сан Ноум 1976 жылы арпаның ұрықтанбаған түйіндерін жасанды ортада өсіріп, бірінші рет нормалы жасыл гаплоидтық өсімдіктерді алды. Содан бері, әр түрлі жабық тұқымды өсімдіктердің ұрыктанбаған түйіндері мен тұқымбүршіктерін өсіріп гаплоидтық өсімдіктерді шығару төңірегінде көп эксперименттер өткізілді. Солар көрсеткендей, гаплоидтық өсімдіктер аналық гаметофиттің іп vitro аномальды дамуының нәтижесінде пайда болады» оның екі жолы бар: эмбриоидогенез және каллустағы органогенез.

Бұндай гаплоидтық өсімдіктердің құндылығы, олар тек аналық белгілермен тұқым куалайды. Аналық гаметофиттен алынған гаплоидтық өсімдіктердің артықшылығы, олар ешқашан альбинос болмайды. Өсірген түйіндер мен тұқым бүршіктердің цитогенетикалык зерттеулерін өткізгенде, ұрық капшығының ішіндегі жасушалары мен қатар қоршаған сомалық жасушаларының да бөлінуі анықталған. Нуцеллус пен интегументтерден диплоидтық және полиплоидтық өсімдіктер пайда болған.

С.Мұқамбетжанов бидайдың ұрыктанбаған түйіндерін өсіріп, олардың өсуі мен морфогенезін зерттеген. Ол көрсеткендей, ұрық қапшығы жасушалары мен оны қоршаған ұлпаларда мынадай морфогенездік процесстер орын алады: гиногенез /өсімдік жұмыртқа жасушасынан түзіледі/, апогаметия /өсімдік синергидалар мен антиподалардан түзіледі/ және адвентивтік эмбриония /өсімдік нуцеллус пен интегумент жасушаларынан түзіледі/.

Сөйтіп, ұрықтанбаған түйіндер мен тұқым бүршіктерін өсіргенде, каллустардың сомалық диплоидтық жасушаларынан пайда болуы әбден мүмкін. Ал аналық гаметофит өсімдік түйінінде дамитын болғандықтан, оны зақым тигізбей жекелеп бөліп алу өте қиын. Тұқым бүршікті механикалық жолмен не болмаса, қоршап тұрған ұлпаларды пектиназалармен ерітіл фермегатік жолмен бөліп алуы жақсы нәтиже берген жок. Сондықтан аналық қасиеттері бар гаплоидтық өсімдіктерді псевдогамия процессі арқылы алу тиімді. Бұл гаплоидтық партеногенездің өте ерекше түрі, ол үшін тозаңдануды Hordeum bulbosum тозаңымен өткізу керек. Жабайы арпа хромосомаларының селективті элиминациясы салдарынан, регенерант өсімдік аналық жасушадан дамиды және аналықтың барлық белгілерін ұстайды.

2. Жасанды қоректік ортада өскен жасушалардан бастапқы материал алу үшін, жаңа әдіс ретінде табиғи және эксперименттік мутагенезді пайдалану тәжірибелерде кеңінен қолданылуда. Жасушалық селекция -сұрыптаушы қоректік ортаны қолданып, мутант жасушалар мен жасушалардың сомаклондык, вариацияларын бөліп алу әдісі. Жасушалық селекция а/ сомалық жасушалар популяциясының өте жоғары өзгергіштігіне; б/ осы өзгергіштікті түрлі мутагендерді қолданып арттыруына; в/ генетикалық жағынан өзгерген жасушалар клонын аныктайтын және іріктеп алатын селективті жүйелер жасауына негізделген. Өзгерген жасушалардан тотипотенттілік қасиеті арқасында өзгерген өсімдіктер алынады. Жасушалар популяцияларында табиғи мутациялар сирек байқалады, сондықтан мутациялар жиілігін арттыру үшін, индукцияланған мутагенезді қолданады. Өте тиімді мутагендер қатарына у-рентген және ультракүлгін сәулені, метилметансульфонат /ММС/ жатады. Жасуша деңгейіндегі сұрыптауды қолданып мутант жасушалар формаларын алу төменде келтірілгендей бірнеше кезеңнен тұрады:

1. жасушалар суспензиясын немесе протопласттарды мутагендермен өңдеу,

2. жасушаларды сұйық коректік ортада өсіру,

3. жасушалар суспензиясын сұрыптау жағдайына ауыстыру,

4. дамып жетіле бастаған колонияларды бөлу,

5. сұрыптау факторына резистенттік /тұрақты/ клондарды іріктеп алу,

6. органогенезді индукциялау,

7. өзгерген өсімдіктер алу.

Жасанды ортада өсірген жасушаларда өзгергіштіктің бірнеше типі болатындығын ескерген жөн, олар: генетикалық, эпигенетикалық, модификациялык, Сұрыптау үшін тек қана тұқым қуалайтын өзгергіштіктің /генетикалық және эпигенетикалық/ маңызы бар екені белгілі.

Антиметаболиттерге, патогендерге немесе стресс факторларға тұрақты мутанттарды іріктеп алу үшін, тура селекция әдісі қолданылады. Мутагенмен өңдегеннен кейін, жасушаларды сұрыптаушы ортада өсіреді. Бұл кезде жасушалардың негізгі бөлігі өледі, тек сол факторға төзімді мутант жасушалар тірі калады.

Кері немесе вегативтік селекция былай жүргізіледі. Жабайы типті жасушалар бөлінеді, ортаға әдейі косылған тимидиннің аналогы ДНҚ құрамына енеді, соның нәтижесінде жасушалар өледі, ал мутант жасушалар көбею қабілетін жояды, бірақ тіршілік қабілетін сақтап қалады. Оларды нормалы қоректік ортаға көшіріп тұрақты линияларын алады.

Жасушалық селекция әдісі арқылы собықтар, сабақ және жапырақ гельмиытоспориозына түракхы жүгері линиялары, фитофторға резистентті картоп линиялары темекі ала мозаикасы вирусына тұракты темекі т.б. өсімдікгер алынған. Қоректік ортада өскен жасушаларға белгілі амин қышкылдарының аналогтарынын, улы концентрациясына сұрыптау жасағанда арнайы аминқышқылдарын мол синтездейтін мутант жасушалар алынған. Сөйтіп бастапқы ата-аналық дақылдармен салыстырғанда бос триптофанды 20-30 есе көп синтездейтін сәбіз және темекі жасушаларының линиялары іріктелініп алынған. Осы әдіс арқылы лизин, метионин, пролин, фенилаланин, глицинді өте көп синтездеуі қабілеті бар картоптың, сәбіздің, жүгерінің, сасық мендуананың т.б. өсімдіктердін линиялары алынған. Жеке амин қышқылдарын көп ұстайтын мутант жасушалардан құрамында ауыстырылмайтын амин қышқылдары мол регенерант өсімдіктер шығуы ғажап емес.

Бұл кұрамында әсіресе ауыстырылмайтын амин қышқылдарының мөлшері көп өсімдіктер алудың бірден-бір жолы. Әр түрлі сұрыптау жүйелерін қолдана отырып, шаруашылықтағы түрлі құнды белгілеріне мысалы, ауруларға, гербицидтерге қарсы тұруға, әр түрлі стресстік әсерлерге /тұздануға, су басуға, төмен және жоғары температураларға/ және басқа төзімділікке бағытталған селекцияны жүргізуге болады.

Әрбір жағдайда мутанттар алу үшін, селекция схемасын жасау және өзгерген жасушалар линияларының генетикалық табиғатын дәлелдеу керек. Алынған өзгерістер барлық уақытта бірдей мутациялармен байланысты емес, модификациялық сипатта болуы және де тұкым куаламауы мүмкін. Мутацияның дәлелдемесі бірнеше белгілер жиынтығы болғандықтан, бұл күрделі жұмыс:

1/ Өзгерген жасушалар жиынтығы өте төмен болуы керек/1*10 - 10⁷ кл/мл /

2/ Мутагендерді колданған кезде өзгерген жасушалар жиілігі әжептеуір жоғарылайды/110~⁴ -10"³ кл/мл /

3/ Өзгерген жасушалар ұзақ уақыт бойы бір қалыпты өсуге қабілетті болуы керек.

4/ Селективтік қысым болмағанның өзінде өзгерген белгінің түрақтылығы

5/ Өзгерген ген өнімінің білінуі.

Гаплоидтық жасушаларға мутаген әсерінің тиімділігі артады, себебі оларда барлық рецессивтік мутациялар ертеден көрінеді. Сондай-ақ протопласттарды да мутагенмен өңдеу, олар біркелкі болғандықтан тиімді келеді. Сондықтан әр түрлі мутацияларды алудың ерекше жолы ол гаплоидтык өсімдіктердің протопласттарын қолдану.

Мутанттарды іріктеп алу үшін гаплоидтық протопласттарды қолданудың үлгісі ретінде Карлсон жұмысын келтіруге болады. Ол табиғатта темекі ауруын тудыратын токсинге ұқсас әсері бар метионинсульфоксиминге тұрақты жасушаларды іріктеп алу үшін, гаплоидтық темекі өсімдігінің протопластарын пайдаланды. Іріктеп алынған жасушалардан пайда болған өсімдіктер ауруға тұракты болып шықты.

Мутанттарды іріктеп алу үшін, гаплоидтық жасушалардың тағы бір түрі микроспоралар болып табылады.

Бақылау сұрақтары:
Дәріс № 14

Мутагендердің жасушаларға əсері.
Сұрақтар:

1. 
   Жасуша деңгейіндегі сұрыптауды қолданып мутант жасушалар формаларын алу
   
2. 
   Мутагенез және іп vitro жағдайындағы жасушалық селекция
   
3. 
   Жасушалық селекция әдістері
   

Жасанды қоректік ортада өскен жасушалардан бастапқы материал алу үшін, жаңа әдіс ретінде табиғи және эксперименттік мутагенезді пайдалану тәжірибелерде кеңінен қолданылуда. Жасушалық селекция - сұрыптаушы қоректік ортаны қолданып, мутант жасушалар мен жасушалардың сомаклондык, вариацияларын бөліп алу әдісі. Жасушалық селекция а/ сомалық жасушалар популяциясының өте жоғары өзгергіштігіне; б/ осы өзгергіштікті түрлі мутагендерді қолданып арттыруына; в/ генетикалық жағынан өзгерген жасушалар клонын аныктайтын және іріктеп алатын селективті жүйелер жасауына негізделген. Өзгерген жасушалардан тотипотенттілік қасиеті арқасында өзгерген өсімдіктер алынады. Жасушалар популяцияларында табиғи мутациялар сирек байқалады, сондықтан мутациялар жиілігін арттыру үшін, индукцияланған мутагенезді қолданады. Өте тиімді мутагендер қатарына у-рентген және ультракүлгін сәулені, метилметансульфонат /ММС/ жатады. Жасуша деңгейіндегі сұрыптауды қолданып мутант жасушалар формаларын алу төменде келтірілгендей бірнеше кезеңнен тұрады: 1/ жасушалар суспензиясын немесе протопласттарды мутагендермен өңдеу, /жасушаларды сұйық коректік ортада өсіру, 3/ жасушалар суспензиясын сұрыптау жағдайына ауыстыру,4/ дамып жетіле бастаған колонияларды бөлу, 5/ сұрыптау факторына резистенттік /тұрақты/ клондарды іріктеп алу, 6/ органогенезді индукциялау, 7/ өзгерген өсімдіктер алу. Жасанды ортада өсірген жасушаларда өзгергіштіктің бірнеше типі болатындығын ескерген жөн, олар: генетикалық, эпигенетикалық, модификациялык, Сұрыптау үшін тек қана тұқым қуалайтын өзгергіштіктің /генетикалық және эпигенетикалық/ маңызы бар екені белгілі.

Антиметаболиттерге, патогендерге немесе стресс факторларға тұрақты мутанттарды іріктеп алу үшін, тура селекция әдісі қолданылады. Мутагенмен өңдегеннен кейін, жасушаларды сұрыптаушы ортада өсіреді. Бұл кезде жасушалардың негізгі бөлігі өледі, тек сол факторға төзімді мутант жасушалар тірі калады.

Кері немесе вегативтік селекция былай жүргізіледі. Жабайы типті жасушалар бөлінеді, ортаға әдейі косылған тимидиннің аналогы ДНҚ құрамына енеді, соның нәтижесінде жасушалар өледі, ал мутант жасушалар көбею қабілетін жояды, бірақ тіршілік қабілетін сақтап қалады. Оларды нормалы қоректік ортаға көшіріп тұрақты линияларын алады.

Жасушалық селекция әдісі арқылы собықтар, сабақ және жапырақ гельмиытоспориозына түракхы жүгері линиялары, фитофторға резистентті картоп линиялары темекі ала мозаикасы вирусына тұракты темекі т.б. өсімдікгер алынған. Қоректік ортада өскен жасушаларға белгілі амин қышкылдарының аналогтарынын, улы концентрациясына сұрыптау жасағанда арнайы аминқышқылдарын мол синтездейтін мутант жасушалар алынған. Сөйтіп бастапқы ата-аналық дақылдармен салыстырғанда бос триптофанды 20-30 есе көп синтездейтін сәбіз және темекі жасушаларының линиялары іріктелініп алынған. Осы әдіс арқылы лизин, метионин, пролин, фенилаланин, глицинді өте көп синтездеуі қабілеті бар картоптың, сәбіздің, жүгерінің, сасық мендуананың т.б. өсімдіктердін линиялары алынған. Жеке амин қышқылдарын көп ұстайтын мутант жасушалардан құрамында ауыстырылмайтын амин қышқылдары мол регенерант өсімдіктер шығуы ғажап емес.

Бұл кұрамында әсіресе ауыстырылмайтын амин қышқылдарының мөлшері көп өсімдіктер алудың бірден-бір жолы. Әр түрлі сұрыптау жүйелерін қолдана отырып, шаруашылықтағы түрлі құнды белгілеріне мысалы, ауруларға, гербицидтерге қарсы тұруға, әр түрлі стресстік әсерлерге /тұздануға, су басуға, төмен және жоғары температураларға/ және басқа төзімділікке бағытталған селекцияны жүргізуге болады.

Әрбір жағдайда мутанттар алу үшін, селекция схемасын жасау және өзгерген жасушалар линияларының генетикалық табиғатын дәлелдеу керек. Алынған өзгерістер барлық уақытта бірдей мутациялармен байланысты емес, модификациялық сипатта болуы және де тұкым куаламауы мүмкін. Мутацияның дәлелдемесі бірнеше белгілер жиынтығы болғандықтан, бұл күрделі жұмыс:

1/ Өзгерген жасушалар жиынтығы өте төмен болуы керек/1*10 - 10⁷ кл/мл /

2/ Мутагендерді колданған кезде өзгерген жасушалар жиілігі әжептеуір жоғарылайды/110~⁴ -10"³ кл/мл /

3/ Өзгерген жасушалар ұзақ уақыт бойы бір қалыпты өсуге қабілетті болуы керек.

4/ Селективтік қысым болмағанның өзінде өзгерген белгінің түрақтылығы

5/ Өзгерген ген өнімінің білінуі.

Гаплоидтық жасушаларға мутаген әсерінің тиімділігі артады, себебі оларда барлық рецессивтік мутациялар ертеден көрінеді. Сондай-ақ протопласттарды да мутагенмен өңдеу, олар біркелкі болғандықтан тиімді келеді. Сондықтан әр түрлі мутацияларды алудың ерекше жолы ол гаплоидтык өсімдіктердің протопласттарын қолдану.

Мутанттарды іріктеп алу үшін гаплоидтық протопласттарды қолданудың үлгісі ретінде Карлсон жұмысын келтіруге болады. Ол табиғатта темекі ауруын тудыратын токсинге ұқсас әсері бар метионинсульфоксиминге тұрақты жасушаларды іріктеп алу үшін, гаплоидтық темекі өсімдігінің протопластарын пайдаланды. Іріктеп алынған жасушалардан пайда болған өсімдіктер ауруға тұракты болып шықты.

Мутанттарды іріктеп алу үшін, гаплоидтық жасушалардың тағы бір түрі микроспоралар болып табылады.

Сомалық жасушалар мен жыныстық жасушаларында жасалатын мутагенез және жасушалық селекциясы генетикалық өзгерістері бар формаларын алудың тиімді жолы. Осы жолдар арқылы бидайдың, арпаның, томаттың, қиярдың гербицидтерге жоғары төзімділігімен ерекшеленетін, топырактың тұздылығына және өнеркәсіптік ластағыштар /ауыр металлдар/ әсеріне тұрақты сорттары алынған.

1. 
   Жасушалық селекция әдістері
   
2. 
   Мутанттарды алу жолдары.
   
3. 
   Кері немесе вегативтік селекцияның әдістері.
   

Протопластарды қосу арқылы будандастыруды әр түрлі атайды: сомалық будандастыру, парасексуальды будандастыру, жыныстық емес будандастыру. Көбінесе бірінші термин колданылады, ал пайда болған будан сомалык будан деп аталады.

2. Протопласт деген ферментердің әсерімен немесе механикалық әдістермен қабығы түгел жойылған өсімдік жасушасы. Ағылшын ғалымы Э. Кокинг 1960-шы жылдардың басында жасушаның ішіндегі протопласты зақымдамай тірі күйінде бөліп алу әдісін жете зерттеп дайындады. Ол томат тамырларының ұштарын, зең саңырауқұлақтар өсірген ортасына бөліп шығарған гидролиздік ферменттерімен өңдеп, протопластарды ферменттік әдісімен бөліп алды.

1968 жылы жапон ғалымы Такебе темекі жапырағынын мезофилл жасушаларынан протопластарды көп мөлшерде алудың тиімді әдісін жете зерттеп дайындады. Алдымен жапырақты 70 %-тік этанолда стерильдейді, кейін 15-20 мин 10 %-тік кальций гипохлоритінде ұстап, дистильденген суда шайып алады. Астыңғы эпидермисті алып тастап, жапырақты майда бөліктерге кесіп, пектиназа ферментінің ерітіндісіне салады. Пектиназа жасуша-аралық қабаттың заттарын ерітеді, яғни мацерация өтеді. Одан кейін объект целлюлаза ферментінін ерітіндісімен өнделеді, бұл кезде целлюлозалық жасуша қабығы біржолата жойылады. Фермент ерітіндісіне осмостық зат қосылады. Осы әдіспен әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларынан протопластар алынады.

Қазіргі уақытта протопластарды бөліп алу үшін ферменттердің коспасын пайдаланады. Бұл қоспаның құрамында ферменттердің үш түрі болады пектиназалар, целлюлазалар және гемицеллюлазалар. Олар жасуша қабығының негізгі компоненттерін ыдыратады. Бұл ферменттерді кейбір бактериялар мен саңырауқұлактар өздерін өсірген сұйық ортаға бөліп шығарады, сонымен қатар оларды ұлудың асқорыту сөлінен бөліп алады. Қазіргі уақытта пектиназалық және целлюлазалық әсері бар бірталай стандарттық ферменттер бар. Олардың фирмалық аттары әр түрлі, атап айтқанда мыналар:

- целлюлазалар

- гемицеллюлазалар;

- пектиназалар:;

- целлокандин мен ксиланаза (бұлар целлюлоза-пектин комплексіне әсер етеді).

Ферменттік ерітінділерді арнайы сүзгіден өткізу арқылы залалсыздандырады. Жасуша түрлерінде құрылымы мен құрамы жағынан айырмашылықтары болғандықтан, қолданылатын ферменттердің комбинациялары мен мөлшерінің ара қатынасы бірдей болмайды. Әрбір ұлпа үшін ферменттердің құрамы, концентрациясы мен ара қатынасы және өндеу уақыты бөлек іріктеліп алынады. Бөлініп алынған протопластар ферменттік ерітіндіде мейлінше аз уақыт болуы керек, одан кейін ұқыпты түрде жуылуы қажет.

Протопластарды бөлу кезінде осмостық стабилизатор маңызды қызмет атқарады. Протопластар бүтін болу үшін ферменттік ерітінділер изотониялық немесе гипертониялық күйде болу керек. Кейде материалды алдын ала плазмолиздық ертіндісінде біраз ұстайды. Осмостық зат ретінде көбінесе қанттар (глюкоза, сахароза, сорбит, маннит) пайдаланылады, кейде СаС1₂, Ма₂НРО₄, КСІ тұздардын ерітіндісі 0,3-0,8 М концентрацияда қолданылады. Осмостық заттың дәл концентрациясы өсімдіктің нақтылы түріне және онын физиологиялық күйіне байланысты жеке іріктеліп алынады. Көбінесе ферменттер кейін протопластарды өсіруге қолданылатын қоректік ортада ерітіліп дайындалады. Ферменттік ерітіндінің рН көрсеткішін бір деңгейде (5,4-6,2) ұстау үшін буфер қосады.

Протопластарды бөлу кезінде аэрацияның маңызы зор. Сондықтан ортаны араластыратын жабдықтар қолданылады немесе ферменттік ерітінді түбіне ғана құйылған Петри табақшасында бөліп шығарады. Протопластарды ала көленкеде немесе қараңғыда бөліп алады. Ферменттік ерітіндіде инкубация уақыты ферменттердің үйлесуіне, рН және температураға байланысты, 1-2 сағаттан 15-16 сағатқа дейін барады. Әрбір нақтылы ұлпа үшін ең тиімді температурамен өндеу уақытын жеке іріктеп алу қажет. Температура әр деңгейде болады, мысалы бидайға 14°С болса, томатқа ең қолайлысы 27°С.

Протопластар бөлініп алынған сон, олар ұлпаның қалдықтары мен ферменттерден тазалануы керек. Ол үшін оларды центрифугалайды немесе сүзіп алады. Инкубациялық қоспаны тесіктері 50-100 мкм електен сүзеді, одан кейін протопласт суспензиясын центрифугалайды. Центрифугалау тәртібі осмостык затқа байланысты. Егер ферменттік ерітіндісі 0,4-0,5 М сахарозада дайындалса, 100-200 § 2-3 мин бойы центрифугалайды. Протопластар үстіне қалқып шығады, оларды Пастер пипеткасымен сорып алып, екі рет тұздың ерітіндісінде шаяды. Тығыздығы төмен басқа осмостық заттарды (маннит, сорбит) қолданған кезде, протопластар центрифугалау кезінде тұнба болып шөгеді. Оларды екі рет жуады. Одан кейін протопластарды тұздың ерітіндісінде немесе 0,4 М маннит, сорбит, глюкоза ерітіндісіне немесе өсіретін қоректік ортаға салып, суспензиясын алады.

3. Протопластарды нәтижелі бөліп алу көптеген факторларға байланысты. Олар атап айтқанда: ұлпаның шығу тегі (жапырақ, тұқымжарнақ, тамыр, тозаң түйірі, каллус ұлпасы, суспензиядағы жасушалар), өсімдіктің түрі мен сорты, өсімдіктің физиологиялық күйі, ферменттердің құрамы, олардың сапасы, ортаның рН және осмостық заттың түрі.

Протопластардың тіршілікке икемділігін, яғни олардын метаболиттік активтігін анықтайтын арнайы әдіс бар. Ол протопластардын флуоресцеиндиацетатпен (ФДА) боялуы. ФДА - бұл флуоресценциясы жоқ қосылыс, протопластар мембранасы арқылы жеңіл өтеді, тірі протопластардың ішінде эстеразалардың әсерімен ыдырайды. Соның нәтижесінде флуоресцеин босайды, оны протопластардың бүтін мембраналары ұстап қалады. Сондықтан метаболиттік активтігі бар (тіршілікке кабілетті) протопластар ультракүлгін сәулесінде көзге көрінеді, себебі ІІІперінде жинақталған флуоресцеин ультракүлгін сәулесімен коздырылып, жасыл сәулені тарата бастайды.

Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың санымен (процент мөлшерінде) белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластардың тығыздығы (суспензиянын 1 мл-дегі саны) суспензияның маңызды сипаттамасы. Егер ұлпаның немесе өсірілген жасушалардың ылғалды массасының 1 граммынан 100⁵ тен ІхІО'¹ дейін тіршілікке икемді протопластар шықса, онда протопластар жақсы бөлініп алынды деп есептеледі.

Жоғарыда айтып кеткендей, протопластардың бөлініп алынатын мөлшері және олардың өміршендігі өсімдіктің түріне, жасына және физиологиялық күйіне, яғни генетикалық және эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты. Протопластарды көп мөлшерде тұрақты алып отыру үшін өсімдіктерді белгілі бір жағдайда өсіру керек және олардың ең қолайлы өсу кезеңін, нақтылы бір мүшесін анықтап таңдап алу қажет.

Іп vitro өскен жасушалар мен ұлпалардан протопластарды бөліп алудың мынадай өз артықшылықтары бар: стерильдік, іп vitro жағдайында өсуге бейімділік. Бірақ жасуша қабықшасының химиялық құрамының күрделі болып өзгеруі және онын калыңдауы ферменттік гидролизді қиындатады. Бүтін протопластардың бөлініп алынуы өсірген жасушалардың ішінде меристемалық жасушаларының сан жағынан үлесіне сай болады, ал ол үшін суспензиядағы жасушаларды жиі-жиі (әрбір 2-3 тоулігіпдс) жаңа коректік ортаға көшіріп отыру керек.

Суспензияда өсірген жасушалардан протопластарды алу үшін ең қолайлы мезгіл, ол жасушалардың өсу кезеңінің логарифмдік фазасының соңында. Осы мезгілде жасуша қабықшалары ферменттердің әсерімен оңай ыдырап, өміршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бөліп алу жағдайлары мен тәсілдеріне байланысты. Жасушаның плазмолиз кезінде сусыздандырылуы және қабығының бұзылуы оны шок күйіне (күйзеліске) душар етеді. Бұл жағдайда цитоплазманың вакуольденуі артады, көптеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар коюланады.

Фермент препаратының сапасы протопластардың бөліп алынған санына, мөлшеріне ғана емес, олардың кейбір қасиеттеріне де әсер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препараттарына қоспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар және басқа ферменттер, фенолдық қосылыстар, тұздар кіреді. Олар плазмалемманың қасиеттерін өзгертуі мүмкін. Осы токсикалық заттардан құтылу үшін және протопластардың шығуын арттыру үшін ферменттерді тазалауға болады. Бірақ айта кететін мәселе, өте жақсы тазартылған ферменттер протопластарды көп мөлшерде алуға тиімсіз келеді. Кейде ферменттер ерітіндісіне қорғаушы заттар (протекторлар) қосылады, мысалы декстранның немесе калий сульфатының 0,5 % ерітінділері. Олар протеиндермен әрекеттесіп, ферменттердін зиянды әсерін төмендетеді.

Инкубациялық ортада иондардың әсіресе кальций мен магнийдің болуы, плазмалемманың тұрақтылығын арттырып, оқшауланған протопластардың сапасын жақсартады. Оқшауланған протопластар механикалық және осмостық стреске өте сезімтал болады. Олар тек ішіне сіңіп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде өздерінің осмостық тұрақтылығын сақтай алады.

Ферменттік ерітіндісінен жуылып тазартылып алынған тіршілікке икемді протопластар шок күйінен шығып, біртіндеп өзінің ішкі жүйесіндегі бұзылған құрылымдарын жөніне келтіріп (репарация), қабығын қайта құруға (регенерация) дайындалады. Толық жарамды изотониялық қоректік ортада (протопласт пен ортаның осмостық қысымы тепе-тең) асептикалық жағдайда протопластар ұзак мезгіл тіршілікке икемді болып, бөлінуге қабілетін сақтайды.

4. Протопластарды іп vitro түрлі тәсілдермен өсіруге болады. Өсіру тәсілі тәжірибенің мақсатына байланысты. Алдымен протопластарды қоректік ортада шайқап жуып ферменттерден тазартады. Сонан соң олардың 1 мл ортадағы санын есептеп алады. Жасайтын тәжірибеге сәйкес олардың тығыздығын керек көрсеткішке жеткізеді. Ол үшін протопластарды әр түрлі көлемі бар ортаға салады. Мысалы, протопластардың тығыздығын асыру үшін оларды аз көлемді ортаға салады. Ал, керісінше, протопластардың тығыздығын азайту үшін оларды қоректік орта мол құйылған ыдысқа көшіреді. Сөйтіп, протопластардың 1 мл ортадағы санын оқтын-оқтын есептеу арқылы олардың тығыздығын істейтін тәжірибеге сайма-сай келтіреді.

Протопластарды сұйық ортада өсіргенде жасушаларды өсірген сияқты олардың тығыздығы жоғары болуы керек. Көбінесе бұл көрсеткіш Імл Ю⁴ - 10⁵ жасуша болады. Егер қоректік орта сұйықталып, протопластар саны бұдан аз болса, онда олар жөнді өсе алмайды. Өте сұйық суспензияда протопластардың ішіндегі тіршілікке қажетті кейбір метаболиттер плазмалемма арқылы ортаға шығып кететін көрінеді. Сондықтан протопластардың тіршіліктік қабілеті едәуір кемиді. Осының дәлелі ретінде мынадай мысал келтіруге болады. Әдетте ісік ұлпалардан алынған жасушаларды суспензияда өсіргенде коректік ортаға ауксин мен цитокинин гормондарын қоспайды. Өйткені бұл гормондар осындай ісік жасушаларының өздерінде түзіледі. Сұйық ортада өсіргенде жасуша кабығы ол гормондардың жасушаның ішінен сыртына шығуын бөгейді де, ондай эндогендік метаболиттерді жасушаның өзі пайдалана алады. Ал ісік жасушалардан бөліп алынған протопластарды суспензияда өсіру үшін қоректік ортаға міндетті түрде экзогендік ауксин мен цитокининді қосу керек. Себебі, жоғарыда айтылғандай, олардың өз эндогендік гормондары жасушаның қабығы болмағандықтан плазмалеммадан шығып кетеді.

Протопластардьщ өсуіне жаксы жағдай жасау үшін «қоректік кабат» әдісін пайдаланады немесе байытылған ортаны колданады, болмаса олар өсіп жаткан ортаньщ көлемін минимумға дейін азайтады. «Астыңғы қоректік қабат» ретінде рентген немесе гамма-сәулелері әсер еткен протопластар мен жасушалар пайдаланылады. Сол әсерден ондай жасушалар бөліну қабілетінен айырылады, бірақ басқа жасушалардың өсуіне жағдай туғызады. Осы әдістің тағы бір түрі, ол нашар өсетін протопластарды жақсы өсетін протопластармен бірге өсіру. Байытылған орталар өсімдіктердің шамалы түрлері үшін ғана оң әсерін тигізеді.

Протопластарды өсірудін кең таралған әдісі, оларды жоғары ылғалдылықта көлемі 20-40 мкл тамшыларда өсіру. Петри табақшасының қақпағында немесе түбіндегі кішкене тамшыларға протопластар автоматтық пипеткамен салынады. Протопластарды өсіру үшін бұл әдістің тиімділігі - материалдар мен уақытты үнемдеп, қоректік ортаның мыңдаған варианттарын тексеруге мүмкіншілік береді. Бірақ бұл әдістін де кемшілігі бар, ол протопластардың тамшының ортасына жайылуы.

1978 жылы украин ғалымы Ю.Ю. Глеба жеке протопластарды қоректік ортаның көлемі 1 мкл дейін микротамшыларда өсіру әдісін жете зерттеп дайындады және өзінің зерттеу жұмысында осы әдісті нәтижелі қолданды. Осындай көлемдегі микротамшыда бір жасуша болса, онда жасуша көлемі мен қоректік орта көлемінің ара қатынасы әдеттегі өсіргендей тығыздығы 1 миллилитрде 10³ жасушасы бар суспензиямен бірдей болады. Протопластарды алдын ала 1-3 күн тығыздығы жоғары (10⁴-10⁵ жасуша) суспензияда өсірсе, кейін сондай суспензиядан алынған жеке протопластарды микротамшыда өсірудің тиімділігі арта түседі.

Протопластарды суспензия ретінде сұйық ортада ғана емес, біраз қоюланған ортада да өсіруге болады. Ол үшін ыдысқа құйылған қоюланған ортаның бетіне жұқа қабат етіп қана протопластарды салады. Бұл әдіс бойынша, сұйық ортамен көлемі тең қоюланған ортада протопластардың концентрациясын екі есе көп етіп өсіруге болады,

Протопластарды агары бар қатты ортада да өсіруге болады. Ол үшін протопластар суспензиясын 1,2 % агары бар жылы (45°С) көлемі бірдей ортамен араластырады. Орта суып қаткан соң оның ішіндегі протопластар бір-бірінен алыстау болып бекітіліп орналасып қалады. Осы агарда орнықтыру әдісі протопластардың әрқайсысының өсуін жеке бақылап отыруға мүмкіндік береді. Агар орнына агароза қолданылса, жасушалардың бөлінуін арттыруға болады екен. Агароза агардың құрамына кіреді, шамасы агар екі полисахаридтің - агароза мен агаропектин - қоспасы. Бұл тәсіл, әсіресе өсу қарқыны бәсең немесе өспей қалған протопластарға қолайлы.

Жасуша қабығы қайта пайда болып, жасушаның алғашқы бөлінуі үшін қоректік заттар орташа мөлшерде қажет болады. Ортаның концентрациясы жоғары болса, протопластардың күй-жағдайы тіпті нашарлауы мумкін. Ал екі-үш рет бөлінгеннен сон жасушалар қоректік заттардың жетіспеушілігінің зардабын шеге бастайды. Егер осы кезде орта байытылмаса, бөлінуі тежеліп, жасушалар тіпті кұрып кетуі де мүмкін. Өсіру кезінде қоректік ортаны байытудың екі жолы бар: жоғары концентрациялы қойылтылған ортаны тамшылап қосып отыру және қатты қоректік қабатты қолдану.

Бірінші жолдын кемшілігі, концентрациясы жоғары ортаны қосқан сайын инфекциялану қауіпі туады. Ал екінші жолы одан тәуірірек, себебі құрамы бай қоректік орта ыдысқа алдын ала қүйылады. Ол қатқан сон үстіне протопластар салынады. Сөйтіп алғашқы күндері протопластар қоректік заттар азырақ ортада өседі, ал кейінірек қаркынды бөлініп келе жаткан жасушаларға астыңғы қатты қабаттан диффузия арқылы қажетті заттар келіп жатады.

Протопластарды да жасушалар мен ұлпаларды өсіретін белгілі қоректік орталарда өсіреді. Протопластарды өсіретін қоректік ортаның негізгі айырмашылығы - кальцийдің концентрациясы 2-4 есе артық және 0,4-0,8 М осмостық заттардың қосылуы. Протопластарды өсіру үшін кеңінен қолданылатын қоректік орталар: өзгертілген Мурасиге-Скуг ортасы (көбінесе ол Нагата және Такебе ортасы деп аталады); Гамборгтың В₅ ортасы және Као мен Михайлюктін ортасы (бұл витаминдермен, амин қышкылдарымен және қанттармен, кейде фитогормондардың күрделі құрамымен байытылған Гамборгтын В₅ ортасы). Бұнда қанттар (ксилоза, рибоза, целлобиоза, манноза, рамноза) осмотик ретінде ғана емес, жасуша қабығынын тез пайда болуына да әсер етеді.

Өсімдіктердің әр түрлерінен бөлініп алынған протопластардың өсуіне қолайлы көптеген қоректік орталар жете зерттеліп ұсынылды. Қоректік орталарды іріктеп алу көбінесе тәжірибеге негізделген. Оның ең лайықты құрамы өсімдіктің түрі тұрмақ, тіпті жеке сорт үшін де таңдалады. Нақтылы әрбір өсімдіктен алынған протопластардың қоректік ортаға реакциясын зерттеу үшін оларды «аспа тамшылар» әдісімен өсіріп, бірнеше факторлары белгілі схема бойынша әр түрлі комбинацияда құралған қоректік орталарында өсіреді. Мысалы, қоректік ортаның екі факторының үш концентрациясының әсерін зерттеу үшін 9 ортаның 9 варианты дайындалады (яғни 9 тамшы), олар диаметрі 5 см Петри табакшасында үш-үштен тор ретінде орналасады. Бұл тәжірибеде ең азы 5 табақша қолданылатын болғандықтан, қосымша факторлардың, мысалы жарық пен температураның әсерінде зерттеуге әбден болады. Протопластарды осіргендегі температура өсімдіктің түріне байланысты 15°С-тан 30°С-қа дейін болады. Әдетте протопластар температураға өте сезімтал. Жарықтың қарқыны 0-ден 2000 люкске дейін болады.

5. Ең бірінші болып 1971 жылы Такебе протопластарды нәтижелі өсіріп, олардан өсімдіктерді шығаруға болатындығын дәлелдеді. Лайықты жағдайда протопластар жасуша қабығын қайта түзіп, кәдімгі нағыз жасушаға айналады. Электрондық микроскоп көрсеткендей, өсімдік протопластарының сыртқы қабатында 10-20 минут өткен сон бірінші целлюлозаның микрофибрильлері пайда болады, ал 20 сағаттан кейін олар қабықтың тығыз торын түзеді. Жасуша қабығының плазмалеммамен байланысының бұзылуы, шамасы, бірден қабықты қайта құру механизмін іске қосады. Ең қызығы, қабығынан айырылмаған плазмолизге ұшыраған протопластың үстінде жаңа қабықтың түзілгені. Қабықтың түзілуінің ерекшеліктері және жылдамдығы бастапқы жасушаның түріне және дифференцировкасына байланысты.

Алқа, крестгүлділер, шатыршагүлділер тұқымдастар өсімдіктерінің протопластары жасуша қабығын 24 сағат ішінде түзеді. 24-36 сағаттан кейін жасушалар бірінші рет бөлінеді, ал 3-4 апта өткен сон каллус жасушаларының колониясы түзіледі. Өсіру кезінде біртіндеп (2 аптадан кейін) ортаның осмостық қысымын төмендетеді, соның нәтижесіңде бөліну жылдамдығы өседі. Содан кейін каллустарды регенерация өту үшін қатты ортаға көшіреді. Каллуста морфогенездің (органогенез) басталуы, яғни өркен мен тамырлар түзілуі регенерант өсімдіктер пайда болуына әкеледі.

Талай өсімдіктердін протопластары сомалық эмбриогенез арқылы да регенерант өсімдіктер түзеді. Оқшауланған протопластардан пайда болған жасушалардың бөлінуге және тотипотенттілігін жүзеге асыруға қабілеттері көптеген факторларға тәуелді:

1) бастапқы ұлпаның түр ерекшелігі, физиологиялық күйі және дифференцировкасы, яғни генетикалық және эпигенетикалық сипаттамасы;

2) протопластарды бөліп алу әдістері мен жағдайлары;

3) протопластарды суспензияда өсіргендегі тығыздығы;

4) қоректік ортаның құрамы;

5) протопластарды өсіру жағдайлары.