Выделяют кумарины из сырья экстракцией органическими растворителями, чаще всего метанолом или этанолом. Спиртовое извлечение очищают от сопутствующих веществ осаждением раствором свинца ацетата основного.
Качественный анализ. Проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя способность кумаринов:
- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);
- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;
- флуоресцировать в УФ-свете.
1. Лактонная проба (предложена Г.А. Кузнецовой). Реакция проводится с контрольным опытом. Извлечение, содержащее кумарины, наливают в две пробирки. В одну из них добавляют несколько капель 10 % раствора натрия гидроксида. Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют по 5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кислоты кумаровой. В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок. При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается, и кумарины выпадают в осадок.
2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после разрыва лактонного кольца. В пробирку добавляют несколько капель свежеприготовленного диазореактива. Чаще всего в качестве диазореактива используют диазотированную кислоту сульфаниловую. При наличии кумаринов раствор приобретает коричнево-красную или вишневую окраску (образуется азокраситель).
3. Реакция микросублимации. Поскольку, как было отмечено выше, при нагревании до 100 ºС кумарины возгоняются с образованием игольчатых кристаллов, для обнаружения их в сырье можно использовать реакцию микросублимации (методика – как для антраценпроизводных).
Игольчатые кристаллы (возгон) растворяются в спирте, затем проводится диазореакция.
Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. При этом используют системы растворителей:
- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);
- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);
- н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:5).
После высушивания хроматограммы сначала просматривают в УФ-свете. Кумарины в зависимости от структуры имеют голубую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флуоресценцию. Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают, и хроматограммы обрабатывают 10 % спиртовым раствором щелочи, после чего их высушивают в сушильном шкафу при температуре 110-120 ºС в течение 2-3 мин и вновь просматривают в УФ-свете (как правило, флуоресценция усиливается). Затем хроматограммы опрыскивают свежеприготовленным реактивом Паули по Кутачеку (диазореактивом), от действия которого кумарины, в зависимости от структуры, окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый и фиолетовый цвета.
