Лекция 7- Медицина және денсаулық сақтау саласындағы микробиологиялық процестерге негізделген биотехнологиялық процестер

1.Микроорганизмдерді ауруларды емдеуде пайдалану тарихы

2. Антибиотик өндірісі

3. Гормондар

1960 жылдардың ортасында жаңа антибиотиктерді алу қиын болғандықтан және алдындағы антибиотиктерге ауру қоздырғыштарының төзімділігі арту себебінен зерттеушілер белгілі антибиотиктерді модификациялау арқылы басқа қосылыстарды алу бағытында жұмыстар жасай бастады. Көп зерттеулер пенициллиндер мен цефалоспориндерге қатысты болды. Олардың құрамындағы төртмүшелі b-лактамды сақина болатындығы белгілі, Сол сақинаға метоксильді топты қосу арқылы жаңа антибиотик түрі – цефамицин алынды.

Пенициллиндер мен цефалоспориндерге деген төзімділік бактериялар, актиномицеттер, цианобактериялар клеткасындағы b-лактамаза ферментінің болуына байланысты. «Мерк, Шарп және Доум» фирмасының зерттеушілері Streptomyces cattleya микроорганизмі бөлетін b-лактамды антибиотиктерге жататын тиенамицин қосылысын алды. Тиенамициндер грам оң және грам теріс бактерияларға қарсы эффективтілігі жоғары. b-лактамазалардың ингибиторларының қатарына клавуланды және оливанды қышқылы жатады (аугментин).

Антибиотиктер 10-30 гендердің әсерлесуінен синтезделеді, сондықтан антибиотик шығымын жоғарылатуға алып келетін мутацияларды туғызу қиынға соғады. Пенициллиннің супер продуценттері б.т Penicillium chrysogenum және Streptomyces auerofaclens штамдары бірізді мутагенез циклдарының және селекция нәтижесінде алынған. Кейбір мутанттар идиотрофты қасиеттке ие. Яғни ол штамдар қажетті қосылыстың жартысын өздері синтездесе, қалған жарты молекуласын ортадан алуы тиіс. Мутациялық биосинтездің мұндай формасы жаңа антибиотик туындыларын алуға мүмкіндік берді (аминоциклитольді антибиотиктер)

Табиғаты микробты ісікке қарсы дәрілер саны шектеулі. Streptomyces verticilliis дақылынан алынған блеомицин ісік клеткаларының ДНҚ-сын үзіп, синтезін тоқтатуға қабілетті гликопептид б.т. Ісікке қарсы агенттердің басқа тобы аминогликозидті бірлік пен антрациклин молекуласының негізінде жасалған. Олардың кемшілігі-жүрек ауруларын күшейтуінде.

Медицинада а.қ. да пайдаланылады. Мыс. аргинин. Ол аспартат н/е глутаматпен бірге бауыр ауруларын емдеуге пайдаланылады. K-Na-аспартат жүректегі ауру сезімін басады, оны бауыр аурулары және диабет кезінде қолданады. Цистин детоксикалаушы препарат ретінде және радиацияға қарсы шара ретінде қолданады. Дигидроксифенилаланин және D-фенилаланин Паркинсон ауруына ем.

Медицинада Scenedesmus жасыл балдыры да кеңінен қолданылады. Балдыр биомассасын этил спиртімен экстракциялап, сілтілі протеазамен гидролиздейді. Ол кезде белоктардың 50пайызы пептидке дейін ыдырайды. Гидролизат құрамында алмастырылмайтын амин қышқылдарының дерлігі болғандықтан ағзаның қалпына келтіру мақсатында, биостимулятор ретінде қолданылады.

Витаминдер – төмен молекулалы органикалық қосылыстар. Олар ағзада түрлі каталитикалық қызмет атқарады. МО-дер түрлі витаминдердің синтезін іске асыруға қабілетті. Бактериялар мен актиномицеттер белгілі жағдайда бұл қосылыстарды түзіп ортаға бөле алады. Әр түрлі МО бұл тұрғыда белсенділігі әртүрлі. В1, В2, биотин, пантотен қышқылын, пиридоксин, никотин қышқылын, каротиноидтарды түзетін МО бар. Бірқатар витаминдерді синтездеудің микробиологиялық әдісі тиімді болып келеді.

Гормондар- организмде түрлі процестерді реттейтін күрделі органикалық қосылыстар тобы. Гормондар өндірісі генді инженерия әдістері ашылған соң мүмкін болды.

Ген инженериясының әдістері медицина үшін қан факторлары (VIII—және IX факторлары) мен иммуномодуляторларын (интерферон және интерлейкин) алу үшін кеңінен қолданылады.Интерферон адам және жануар клеткаларында инфекциялық вирустарға қарсы синтезделеді. Олардың антивирустық активтілігі бар, сонымен қатар қатерлі ісіктердің (рак ауруының) көбеюін тодтата алады. Интерферонның үш түрін ажыратады: а—интерферон лейкоциттерде вирустарға қарсы түзіледі;  — интерферон — фибробластарға вирустар әсер еткенде түзіледі және иммундық деп аталатын  — интерферон, Т — лимфоциттерде вирустық немесе бактериялық антигендерге және қатерлі ісіктерге қарсы синтезделеді.

Жыныспен тіркес гемофилия ауруы туралы айтылған болатын. Гемофилияның типіне (А және В), байланысты оны емдеу үшін организмге VIII және IX қан   факторларын көп мөлшерде енгізу   керек. Осы уақытқа   дейін препараттарды   донор қанынан алғандықтан оның құны өте жоғары болды. Ген инженериясының әдістерін қолдану бұл проблеманың шешімін жақындатты.   Сегізінші фактордың генін лямбда фаг арқылы барлық басқа гендер жинағына ДНҚ   арқылы бөледі. Мөлшері   белгілі барлық басқа гендермен салыстырғанда VIII фактордың гені бәрінен ұзын болып шықты: 186 000 н. ж. Оның 26 зкзоны және 25 интроны бар. Осындай ұзындығына байланысты гендер жинағында ешқандай фагта ген   толық болмады, сондықтан оның әр түрлі бөліктері бір молекулаға біріктірілді. Мұндай алып ген жануар клеткасында ғана өз жұмысын іске асыра алады және тек сонда ғана VIII фактордың   активті формасы синтезделуі   мүмкін. Генді зертхана жағдайында оңай өсіруге болатын атжалман клеткаларына енгізгенде VIII фактор   синтезделді. Сөйтіп, ген инженериясы арқылы тағы да бір бағалы медидиналық препарат алынды.Генинженерлік Е. СоІі көмегімен алынатын IX фактор гемофилияның В-типін емдеу үшін кең қолданылуда.

2.Зерттеу жұмысының басында интерферон генін алу қиын болды, өйткені белоктың құрылымы белгісіз болатын. Бұл синтетикалық генді және клонды табу үшін кажет синтетикалық олигонуклеотидтік сүңгіні құрастыру мүмкіндігін қиындатты. Осы себепке байланысты ген клонын алу үшін интерферон иРНҚ-сының кері транскрипция әдісі қолданылды.

Лейкоциттік  — интерферонды алғаш рет 1980 ж. «Биоген» компаниясының зерттеушілері Гилберт пен  және фин ғалымы Кантелл генетикалық құрастырылған ішек таяқшасы бактериясынан алды. Лейкоциттік интерферонның генін алу үшін Сендай вирусымен жұқтырылған лейкоцит клеткаларынан иРНҚ фракцияларын бөледі. Ревертаза арқылы синтезделген қтДНҚ ұшына олиго — dГ жалғайды, ал рестриктаза Рst I арқылы үзілген рBR 322 плазмидасының ұшына олиго — dЦ жалғайды. Рst I бойынша ендірме плазмиданың tet генін инактивациялайды. Сондықтан рДНҚ енген гибридті клеткаларды алғашқы сұрыптау тетрациклинге төзімділік бойынша өтеді. Лейкоциттік а — интерферонның геномында интрон бөліктері жоқ және де глюкозаланбаған (сахар қалдықтары жоқ) . Осыған байланысты  — интерферонның рекомбинантты генінің экспрессиясын Е. СоІі клеткасында іске асыру қиын емес. Ал, геннің өзін кері-транскрипция арқылы синтездеу өте күрделі, өйткені интерферон иРНҚ-сының мөлшері тіпті лейкоциттердің өзінде жеткіліксіз. 1982 жылы М.Н. Колосов тобы адамның — интерферонының синтетикалық генін синтездеп, оған бактериялық реттеуші элементтерін (промоторды, Lас-оперонның операторын SD- тізбегін) жалғау арқылы   геннің Е. СоІі клеткасындағы экспрессиясын бақылады.

АҚШ, Жапония, ГФР, Швейцария, Ресей, Франция мен Англияда Е. СоІі негізінде алынған ген-инженерлік интерферон барлық түрлерін өндірістік деңгейде шығару үшін қазір оларды соңғы клиникалық тексеруден өткізуде. Интерферон өндіру үшін ішек таяқшасынан басқа Меthylomanus, Salmonella, Рreudomonas т. б. грамтеріс бактериялар пайдаланылады. Фибробластық  — интерферон геномында да интрондар жоқ, бірақ олар — интерферон сияқты глюкозаланған белок болып саналады. Сондықтан —   — интерферондарды Е. Cоlі клеткасынан алудың азда болса кемшілігі бар. Алайда, бұл кемшіліктерді ген инженериясының әдістерін пайдаланып, жоққа шығаруға болады. Алдымен 1981 ж. Вашингтон университетінің  генетиктері Аммерер және Холл «Генентек» зерттеушілерімен бірігіп, лейкоциттік интерферонды генетикалық құрастырылған ашытқы клеткаларында синтездеді. Бактериялық клеткамен салыстырғанда ашытқы клеткасында синтезделген интерферонның мөлшері 10 есе көп болды. Бұдан кейін  — және  — интерферондарды ашытқы клеткаларында синтездеу іске асты. АҚШ-тың «Цетус» биотехнологиялық фирмасы рекомбинантты  — интерферонды сүтқоректілер клеткалар культурасында синтездеу жұмысын іске асыра алды. Мұнда эукариоттық клеткада глюкозалау өткендіктен  интерферонның синтезделуі 300—500 есе көбейді. Адамның  — интерферонының гені 12—хромосомада орналасқан және үш интрон мен төрт экзоннан құралған. Осыған қарамастан 1982 ж. жапон «Сантори» компаниясының зерттеушілері  — интерферонның рекомбинантты генінің клонын Е. СоІі клеткасында көбейте алды. «Генентек» компаниясы  — интерферонның синтезін бактериялық ашытқы және маймыл клеткаларында іске асырды: 1 л Е. СоІі культурасында  — интерферонның 25000 бірлігі, ал 1 л ашытқы клеткасының культурасында —1 млн. бірлігі және 1 л маймыл клеткасының культурасында иммундық интерферонның 100 000 бірлігі синтезделді. Иммундық интерферондарды ген-инженерлік әдіс арқылы синтездеу қатерлі ісік пен лейкоз ауруына қарсы күрес жеңілденеді деген үміт туды.

Биотехнологиялық жолмен (Е. СоІі клеткасында) сәйкес геннің клонын көбейту арқылы алынатын интерлейкиндер (ұзындығы 150 амин қышқылдар шамасындағы қысқа полиептидтер) организмнің иммундық жүйесін қалпына келтіру үшін аса қажет. Ген инженериясы негізінде алынған әр түрлі рекомбинантты интерлейкиндерді рак дертіне қарсы қолдану кең қанат жаюда.

3. Ген инженериясы қолданылуының басқа саласы — жаңа, тиімді, қауіпсіз және арзан вакциналарды алуға байланысты. Организм иммунитетін қалыптастыру үшін қажет вакцина өлі (бірақ антигендік қасиеттерін сақтаған) немесе тірі (вируленттік активтілігі жоқ вирус) болуы мүмкін. Тірі вакциналар тиімді болып саналады, бірақ оны қолданудың қауіптілігі бар: кері мутация нәтижесінде активті формаға айналып кетуі мүмкін. Осыған  орай вирустық таза белок-антигенді генинженерлік жолмен Е. СоІі клеткаларынан алып, организмге ендіру идеясы туды. «Нуклеин қышқылынсыз вирус» көбейе алмайды, ал таза антиген “мутацияланбайды”.Францияның «Трансжен» компаниясының зерттеушілері 1982 ж. құтырық ауруына қарсы генинженерлік вакцинаны Е. СоІі клеткасыңда синтездей алды. Құтырық вирусымен инфекцияланған клеткалардан бөлінген иРНҚ негізінде вирус белогын коделейтін рекомбинантты ДНҚ молекуласы құрастырылды. Оларды бактерия клеткасына енгізгеннен кейін, молекулалық массасы 58 000 дальтон иммуногендік активтілігі бар вирустық белок түзілді. Құтырық ауруы зооноз (адамға малдан жұғатын ауру) болып саналады. Бұл аурудың жабайы  және үй хайуанаттарында кездесуі жиі байқалып жүр. Оған қарсы вакцина егудің кедергілері вирусты эукариоттар клеткасында көбейту күрделілігіне және оны клеткадан бөлу, инактивациялау және вакцинді тазалау қиындықтарына байланысты. Сондықтан арзан генинженерлік вакцинаны иммуногендік қасиеті бар вирустық белок негізінде алудың медицина және ветеринария үшін маңызы зор.

Вирустың бірнеше белоктық қабықтан құралғанын біз білеміз, бірақ солардың ішінен бірлі-жарымының ғана антигендік активтілігі байқалады. Сондықтан иммундеу үшін вирустың толық белогының қажеті жоқ, антигендік активтілігі бар жеке белоктар әбден жеткілікті. Мұндай вакциналарды суббөлікті деп атайды. Мысалы, құтырық вирусының қабығын бес түрлі белок құрайды: нуклеокапсид, М₁ және М₂ матрицалық белоктар, гликопротеин G. Ал, вирустық антигендік активтілігін гликопротеин G ғана қамтамасыз ете алады.

Қазіргі кезде ген инженерлік суббөлікті вакциналар аусыл және гепатит вирустары үшін алынды.Аусылдың ірі қара, қой және шошқа шаруашылығы үшін зиянды әсері көп. Бұл дерттен көп мал өлмесе де, ол малдың тез жүдеуіне және өнімділігінің күрт төмендеуіне әкеледі. Аусылмен күресу үшін инфекция ошағын — дертке ұшыраған малды сойысқа салу арқылы жою керек. Бұдан басқа малдың сүті _ мен етін өткізуге тыйым салынады, нәтижесінде мал шаруашылығы үлкен шығынға ұшырайды. Аусылды жою үшін жыл сайын дертке ұшыраған малдарға вирусты инактивациялау арқылы алынған вакцинаның 1 млрд. мөлшерін егуде, бірақ осыған қарамастан ауру әлі де болса кең таралуда. Осындай жолмен алынған вакциналардың бірнеше кемшіліктері бар: вирустың кейбір штамдарын жаңа туылған атжалманның бүйрек   клеткаларында   немесе бұзау тілінің   эпителий клеткаларында жеткілікті мөлшерде өсіру мүмкін болмады; бұдан басқа, вирустық бөліктер өте тұрақсыз, әсіресе рН<7 болса, вакцинаның активтілігін сақтау үшін оны төмен температурада ұстау керек. Вирустың алуан түрлі (60-тан астам) болуы поливалентті вакциналар синтездеу қажеттілігін көрсетеді. Осы аталған жайттарға сәйкес мал аусылымен тиімді күресу үшін ғалымдардың алдында ген инженерлік вакцина синтездеу проблемасы пайда болды.

Аусыл вирусының өзекшесі жалғыз тізбекті РНҚ-дан құралған, оның қабығы төрт түрлі белоктардан түзілген: VP₁, VР₂, VР₃ және VР₄. Олардың ішінен, иммуногендік активтілік тек VР₁ белогында ғана байқалатыны мәлім болды (Уайлд және т. б., 1969; Лапорт, 1973).

Алмания зерттеушілері (Г. Купер және т. б., 1981) вирустық РНҚ-ның қтДНҚ копиясы клонын Е. СоІі бактериясының рВR 322 плазмидасы арқылы көбейте алды. Мұнда плазмидаға VP₁ белогын коделейтін нуклеотидтер енгізілді, нәтижесінде бактериялық клетка VP₁белогының 1000-нан астам молекуласын синтездей алды. 1984 жылдан бастап АҚШ ауыл шаруашылық министрлігі «Генентек» компаниясымен бірігіп, бактериялық клеткада жоғары мөлшерде синтезделетін жаңа рекомбинантты вакцинаны мал дәрігерлері үшін шығара бастады.

Рекомбинантты ДНҚ технологиясы бактериялардың патогенді штамына қарсы биотехнологиялық вакциналарды қолдануға мүмкіндік береді. Голландияның «Интервет интернэшнл» мал дәрігерлік фармацевтік компаниясы 1982 ж. шошқа мен ірі қараның инфекциялық диареясына қарсы қолданылатын вакциналарды сатылымға қойды. Ауру Е. СоІі бактериясының патогенді штамм арқылы дамиды және мал ішінің өтуі бактериялық К 88 -(шошқада) және К 99 (сиырда) антигендеріне байланысты. Осы антигендерді коделейтін геннің клонын «Интервет» зерттеушілері синтездей алды Е. СоІі клеткаларынан алынған рекомбинантты вакцинаны шошқа мен сиырларға енгізгенде антизаттар түзілді.

Жылқының ринит, тауықтың кокцидиоз, ірі қараның оба т. б. ауруларына қарсы рекомбинантты вакциналарды ген инженериясы негізінде бактериялық клеткадан алуға болады (Дж. Тимоней, 1987; П. Петер және т. б., 1987; Т. Илма, 1990). Рекомбинантты ДНҚ технологиясы арқылы синтетикалық вакциналар алудың маңызы өте зор. Мұндай вакциналар бөтен антигендері болуына   байланысты зиянды әсері бар бактериялық және вирустық вакциналардың орнына тиімді қолданыла бастады. Ірі қараның   аусыл,   жануарлардың – коклюш т.б. ауруларына  қарсы синтетикалық   полипептидтерді ген   инженериясы әдісімен алуға болады.

Адамзат үшін өте қатерлі аурулардың бірі — ҚИЖС (орыс. СПИД-қабылданған иммуножетімсіз синдромы). Бұл аурудың қоздырушысы болып HIV-3 ретровирусы саналады, олар иммундық жүйенің басты элементі —Т-лимфоциттерді зақымдап, организмге енген антигендерге қарсы түзілетін антизаттар синтезделуін жеткіліксіз етеді. Қазіргі кезде бірнеше дамыған елдерде осы ауруға қарсы табиғи және синтетикалық генинженерлік вакциналарды синтездеу тәжірибелік жолға қойылуда. Мұндай жұмыстардың негізі HIV-3  вирусы сыртқы қабығының құрамына енетін белок — гликопротеид (gr 102) бөлігінің рекомбинантты генін құрастыру арқылы іске асады. «МинроГенИнс» фирмасы ҚИЖС вирусы gr 120 блогының азғана бөлігінің синтетикалық көшірмесін рекомбинантты ДНҚ арқылы алды. Алынған жасанды полипептидті адамға енгізгенде, олар HIV-3 вирусына қарсы антизаттар синтездей алды.

Ген инженериясының әдістері медициналық және мал дәрігерлік диагностикада жаңа мүмкіндіктер береді. Мысалы, вирусттық немесе бактериялық ДНҚ немесе РҢҚ-сын тым аз мөлшерде бөліп алып, олардың құрамын анықтауға болады. Осындай жолмен алынған мәліметтер ауру қоздырушыларын анықтауға мүмкіндік береді.

Жоғарыда келтірілген мәліметтерден ген инженериясы негізіндегі биотехнологияның үлкен жетістіктерге жеткенін байқауға болады. Болашақта Бұл әдістің шексіз мүмкіндіктерін тиімді пайдаланып, соның ішінде тұқым қуалайтын аурулар генотерапиясын іске асыру қажет. Мысалы, адамда бүгінгі күні 2000-дай тұқым қуалайтын  ауру белгілі, олардың әрқайсысы қайсыбір ферменттің немесе белок факторының жетіспеуінен дамиды. Осындай белоктық заттардың рекомбинанты генінің жұмысын бүкіл организмде іске асыру ген инженериясы негізіндегі, биотехиологияның болашақтағы мақсаты болып саналады.