ПЦР- метод получения большого количества специфических нуклеотидных последовательностей ДНК in vitro. Амплификация-умножение определенных генов или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате реакции исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и индентифицирован.
Этапы:
Денатурация- разъединение определяемой двухцепочечной ДНК на две изолированные цепочки при нагревании до 90-95 градусов по Цельсию в течении 0.5-1 минут.
Отжиг- восстановление двухцепочечной структуры определяемой ДНК в области присоединения комплементарного праймера при температуре 40-60 0.5 минут.
Удлинение (элонгация)- достройка каждой цепи определяемой ДНК до исходного двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК- полимеразы- проводится при температуре 70-75 в течение 2-5 минут.
Конвенциональная ПЦР В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.
ПЦР в реальном времени В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.
Цифровая количественная ПЦР Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.
