Практикум Астана 2017 Қазақстан республикасы ауыл шаруашылығы министрлігі
жүктеу/скачать 3,86 Mb.
|
genetika prnov. kaz (1)
| 6.2 Қан топтарын анықтау әдістері
Сабақтың мақсаты: Қан топтарын анықтауға қолданылатын приборлар және жабдықтармен танысу; ірі қара, шошқа және тауық қан топтарын анықтау әдісімен танысу; гемолиз, агглютинация және Кумбс үлгісі реакцияларының спецификалық ерекшеліктерін анықтау. Ірі қара мен қойлардың қан топтарын гемолиз реакциясы арқылы анықтау Материалдар мен жабдықтар. Үш жануардан (атасы, анасы, ұрпақ) алынған пробиркадағы консервант қосылған қан, реагенттер, физиологиялық ерітінді, 10 мл суспензия дайындауға арналған пробиркалар, иммунологиялық пробиркалар немесе шұңқырлары бар полиэтиленді блоктар, центрифуга, штативтер, градуировалды пипеткалар, 0,05 мм пастер пипеткалары (стандарттыны алған жөн), термостат, гемолиздік тестер парақтары. Әдістемелік нұсқаулар. Ірі қарадан пробиркаға 10 мл қан консервантпен (антикоагулянт) арақатынасы 1 : 5 болып алынады. Консерванттың құрамы: натрий лимонды қышқылы - 50г, натрий цитраты - 32,0 г, глюкоза - 10,0 г, дистилденген су – 1000 л. Ерітіндіге 2-3 г стрептомицин қосады. Қан топтарын анықтауды бірегей халықаралық сынақтан өткен реагенттердің (моноспецификалық сарысулар) көмегімен гемолиздік тестерде өткізеді. Эритроциттерді плазмадан бөліп алу үшін қанды 1,5 мың айналым/мин 10 мин центрифугациядан өткізеді, содан соң пробиркадан тұнба үстіндегі сұйықты сорып алады. Пробиркаға физиологиялық ерітінді қосып қайтадан центрифугациялайды. Эритроциттерді плазмадан алу үшін үш рет жуады. Мұқият жуылған эритроциттерден 2,5%-дық суспензия дайындайды Ол үшін градуирлі пипеткамен 0,25 мл жуылған эритроциттерді өлшеп алады, оған 9,75 мг физиологиялық ерітінді қосады. Суспензия эталон ретінде алынады, оның түсіне қарай аттестациядан өтетін барлық жануарлардың эритроциттерінің суспензиялары дайындалады. Полиэтиленді блок шұңқырларына немесе иммунологиялық пробиркаға стандартты пипеткамен (немесе пастерлі) екі тамшыдан реагент құяды, оған зерттелетін жануардың 2,5% суспензиясының бір тамшысын (0,05 мл) қосады. Қоспаны мұқият араластырып бөлме температурасында 15 мин қояды. Содан соң, бір тамшыдан комплемент қосады. Қоспаны сілкіп тағы 30 мин қойып мұқият араластырады, 26-28° температурада 2-2,5 сағат бойы инкубациялайды. Осы уақыттан кейін реакцияны алғаш рет көріп, қоспаны сілкіп, сол темпертурада қоспаны термостатқа тағы 3,5 сағатқа қояды. Эритроциттің антигені болса сарысуда гемолиз пайда болады: эритроциттің қабықтары жарылады, гемоглобин қабықтан шыққан соң, сұйықты күңгірт түске бояйды. Гемолиз толық өткенде сұйық лак түсті болуымен сипатталады (4 бал), жартылай гемолиз 3, 2, 1 балымен, реакцияның болмауы – ноль болып бағаланады. Реакция өтпесе эритроциттер пробирка түбіне тұнып, сұйық боялмай қалады. Тауықтардың қан топтарын тікелей агглютинация әдісімен анықтау Материалдар мен жабдықтар. Эритроциттер суспензиясы, реагенттер және қан топтарын анықтауға арналған жабдықтар. Әдістемелік нұсқаулар. Тауықтардан қанды қанатының тамырынын алады. Ірі қара үшін алынған консерванттар қолданылады. Тауықтардың қан топтарын тікелей агглютинация реакция көмегімен анықтайды, ол үшін эритроциттер суспензиясын дайындайды. Пастер пипеткасының көмегімен иммунологиялық пробиркаларға бір тамшы реагент тамшысын құяды, содан соң әр зерттелетін дарақтан эритроциттердің бір тамшы 2,5% суспензиясын құяды. Пробирка сұйықтығын сілку арқылы араластырып, инкубациялау үшін температурасы 37° термостатқа 30 мин қояды, қайтадан сілкіп 30 мин термостатта қалдырады. Реакцияның бірінші оқуын 4 балдық жүйеде жүргізеді. Эритроциттердің бір түйірге жабысуын 4 балмен бағалайды; нашар реакция беретін эритроциттердің әртүрлі мөлшерлі бірігуін 3 балмен; ұсақ түйіршектерді 2; агглютинацияның нашар реакциясында - 1; реакция жүрмеуі – 0 бал. Бірінші рет оқылғаннан кейін эритроциттер суспензиясы қоспасын сарысуымен мұқият сілкіп бөлме температурасында 2 сағатқа қалдырады. Реакцияны екінші рет оқып хаттамада агглютинацияның бірінші бағалау бағасының жанына түрлі-түсті қарандашпен қорытынды баға қояды. Шошқалардың қан топтарын анықтау Материалдар мен жабдықтар. Шошқалардың пробиркалардағы консервант қосылған қандары, реагенттер, физиологиялық ерітінді, антиглобулинді сарысу, центрифуга, бюреткасы бар штатив, иммунологиялық пробиркалар, термостат, гемолитиздік тестер парақтары. Әдістемелік нұсқаулар. Шошқалардан қанды алдыңғы күретамырдан немесе құйрығының ұшындағы тамырлардан алады. Белгіленген пробиркаларға бір тамшы реагент құяды, физиологиялық ерітіндімен үш рет жуылған эритроциттердің 2,5%-дық суспензиясын бір тамшыдан құяды. Сілку арқылы мұқият араластырып пробиркаларды қоспасымен 0,5 сағ термостатқа қояды, пробиркаларды қайтадан сілкіп температурасы 37° термостатқа тағы да 0,5 сағ қояды. Инкубация барысында өздеріне сәйкес нашар антигендері бар антиденелер эритроциттерде қалады. Инкубациядан кейін агглютинация реакциясын оқиды. Шошқалар қанының барлық антигендері тікелей агглютинация әдісімен анықталмайды. Екінші кезең – эритроциттер қабығындағы толымсыз агглютининдерді антиглобулинді сарысу көмегімен (фиксация) анықтау (Кумбс үлгісі). Эритроциттерді барлық пробиркаларда үш рет физиологиялық ерітіндімен жуып, олардан 1%-дық суспензия дайындайды. Суспензияларды пробиркаларға бір тамшыдан құйып оған антиглобулинді сарысудың бір тамшысын қосады. Қоспаны сілку арқылы мұқият араластырғасын 15 мин қалдырады, одан кейін пробиркаларға құйып 2-3 мин 1-1,5 айналым/мин центрифугадан өткізеді. Центрифугациядан кейін пробиркаларды штативтерге орналастырады, реакциялар нәтижелерін бес балдық жүйе бойынша бағалайды; реакцияның жүрмеуін минуспен, эритроциттер түйірлерге жабысқанда ең күшті реакция жүреді, оны төрт плюспен белгілейді. жүктеу/скачать 3,86 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|