Практикум Астана 2017 Қазақстан республикасы ауыл шаруашылығы министрлігі
Ақуыздар полиморфизмін электрофорез әдісі арқылы зерттеу
жүктеу/скачать 3,86 Mb.
|
genetika prnov. kaz (1)
- Бұл бет үшін навигация:
- 6.4 Моноспецификалық сарысу-реагенттерін дайындау
| 6.3 Ақуыздар полиморфизмін электрофорез әдісі арқылы зерттеу
Электрофорез әдісін электр тогы әсерінен ерекше ерітіндіде болатын (буферлі) ақуыздар мен ферменттер фракцияларын бөлу үшін қолданады. Бұл ерітінді түрлі ақуыздар үшін бірдей дайындалмайды. Электр жүйесінде зарядына байланысты түрлі ақуыздардың молекулалары анод жағына қарай әртүрлі жылдамдықпен қозғалады. Организмнің қан сарысуында, сүтінде және басқа сұйықтарында электрофорез әдісінің крахмалды және полиакриламидті гелиінде ақуыздар мен ферменттердің көптеген генетикалық варианттары ашылды. Электрофорездік варианттар Мендель белгілері тәрізді кодоминантты тұқым қуалайды. 6.4 Моноспецификалық сарысу-реагенттерін дайындау Донор тобын құрастыру. Моноспецификалық сарысу алудың маңызды шарты 150-200 қой басы болуы қажет. Донор табыны 1,5 және одан жоғары жастағы қошқарлардан құрылады. Таңдау әртүрлі тұқымдарда жүргізілуі тиісті, өйткені кейбір антигенді факторлар 89-100% кездеседі. Мысалы, Cb және Mb- кавказ, Ма- қаракөл тұқымдарында кездеседі. Осыдан басқа, тұқым аралық иммундау жоспарланған антиденелерді алуға мүмкіндік береді. Жануарлар құлақтарында нөмірлер болуы керек. Оларға қосымша таңба салынады. Алынған жануарлардан жоспарлы шаруашылық өнімін алу қажет етілмейді. Қойларды жеке топта бағып күтеді, 60-80 басты күнделікті жұмысқа бөледі. Олардан «шикі» сарысу абсорбциясын, арнайы тексеру және реагенттер белсенділігін анықтау үшін қан алады. Сарысулар продуценттері (донорлар және реципиенттер) тобын құрайды. Жиналған тәжірибелерге сәйкес, донорлық табын қой қандары эритроциттерінің құрамы қан топтарын зерттейтін халықаралық ұйымның ғылыми-зерттеу орталығында расталуы тиіс. Донорлар мен реципиенттерді таңдау. Изоиммундаудың мақсаты – белгілі бір иммундық антиденелі сарысуларды алу. Донор мен реципиенттерді дұрыс таңдау аса маңызды. Донор тобы жануарлары реципиенттерде антидене түзе алатын антигендерге ие болуы қажет. Көптеген реципиенттердің жиі иммунологиялық ареактивті болатындығы анықталды. Оларды эритроциттермен изоиммундау антидене түзілуін қамтамасыз етпейді. Сондықтан, қажетті антидене алу мүмкіндігін арттыру үшін реципиенттер тобына сәйкес қосымша донорлар болуы қажет. Реципиенттердің саны қажетті антиденелер санымен анықталады. Алынатын иммунды «шикі» сарысулар өте күрделі болмауға тиіс, себебі олардың құрамына көптеген түрлі антиденелер кіреді. Екінші жағынан көптеген реципиенттер иммунологиялық ареактивті болады және антидене түзбейді, сондықтан әрбір донорға бірнеше реципиент тіркеу қажет. Әдетте қойларды донор-реципиент жұбын таңдауда 1-3 антиген фактор айырмашылығы есепке алынады. Егер донорда бір антиген артық болса, реципиенттің иммундық сарысуы дайын реагент болады. Мысалы: Донор В-3: Aa, Ab, Bb, Bc, Be, Bi, Da. Реципиент- 866: Aa, Ab, Bb, Bc, Be, Bi, R, O. Донор 162: Aa, Bb,Bg, Bc,Bd , Bi, Da, Ca, Ma. Реципиент- 2472: Aa, Ab, Bb, Bc, Bd, Bi, Da, Ca, Cb. Жануарлар қан топтарын салыстыру бірінші реципиентте Da, екіншіде Bg және Ма антигендері болмайтындығын көрсетті. Сондықтан, бірінші реципиент анти-Da, екінші – анти-Bg және анти-Ма антиденелерін түзейді. Жануарларды осылай таңдағанда иммундау жоспары құрылады. Антиденеге қарсы антигендерді алу үшін бірнеше реципиентпен жұмыс істеу керек, өйткені барлық факторларда антигендік қасиеттер болмайды. Иммундауға дейін барлық таңдалған жұптар қиғаш (жанама) гемолиз реакциясымен тексерілуі тиісті. Реципиент сарысуында, әсіресе анти-R-ға реакция болған жануарларды шығарып тастау керек. Себебі, табиғи анти-R абсорбциямен қиын алынып тасталады және басқа сарысуларды алуға кедергі келтіреді. Жануарларды изоиммундау. Иммундаудың көптеген схемалары мен әдістері болады. Зертханалық жануарларға (үй қояндары, тышқандар және т.б.) жиі күретамыр, бұлшықет және тері асты әдістері мен антигендерді енгізеді. Қойлардан сарысу –реагент алу үшін алғашқыда күретамыр ішілік әдіс қолданылады. Бірақ, қосалқы анафилактикалық құбылыстарға байланысты ол қауіпсіз бұлшықет әдісіне ауыстырылады. Регионарлы лимфа түйіндер орналасқан орындарға күретамыр және бұлшықет арқылы қанды енгізу, тек бұлшықет әдісіне қарағанда, антиденелердің қарқынды түзілуіне әкеп соғады. Иммундауды жүргізу үшін донор күретамырынан консервантпен бірге флакондарға арақатынасы 4:1 қан алынады. Консервленген қанды төрт аптаға дейін 4о С тоңазытқышта сақтауға болады, оны бірнеше иммундау үшін қолдануға болады. Қойлар иммунизациясы бұлшық ет әдісі арқылы жүргізіледі. Жануар жамбасына алдымен ине енгізіледі, одан кейін оған қанмен толтырылған (10 мм) шприц қосылады. Үшінші инъекциядан бастап антидене титрі түзілуін анықтау үшін реципиенттен 10 мл қан алынады. Титр 1-32-ден асқанда инъекция тоқтатылады. Иммундау аяқталған соң, бір аптадан кейін инъекция тоқтатылады. Кавказ тұқымы қойларының денсаулықтарына зиянсыз 0,5-0,16 литр қан, ірі жануарлардан 0,8-1 литрге дейін қан алынады. Қойларды қайта иммундау. Бірінші иммундаудан кейін 2-3 ай өткен соң, қойларды қайтадан иммундайды. Әдетте 50-65% жуық реципиент қойлар бірінші иммундаудан кейін қажетті антиденелерді түзбейді немесе төмен титр түзеді. 3-4 рет қайта иммундаудан кейін, осындай жануарлар жиі антиденелер түзеді (барлық жағдайда емес). Бұл көрсеткіш орташа есеппен 70-80% құрайды. Осыған орай, иммундағанда қан сарысуының антидене титрі біртіндеп артады, қайта иммундау кезеңінде бірде артып, бірде төмендейді. Поливалентті сарысуларда қайта иммундаудан кейін, антидене титрлері бірінші циклден 2-5 есе артық болады. Бірінші иммундау циклінде әлсіз титрлі иммундық антидене әлсіз антигендерге қарсы антиденелер құрайды, сарысулар алу үшін қайта иммундау тиімді болып есептелінеді. Донор эритроциттерін сондай факторлармен қайта иммундау, сарысулар титрін арттырудың тиімді әдісі болып табылады. Бірақ, қайта иммундауда жиі қажетті антисарысу алынбайды. Осының барлығы иммунологиялық үрдістердің толық зерттелмегендігін көрсетеді. Иммунологиялық белсенділік. В.Н.Тихонов зерттеулері кейбір реципиент–жануарлар антиденелерді донорды ауыстырғаннан кейін ғана түзетінін көрсетті. Иммундауда осындай жануарлар саны 50 пайыз және одан жоғары болады. Осы жағдайда донор эритроциттері зор роль атқарады. И.Матоушектің айтуынша, жеке эритроцитарлы факторлардың антигендік белсенділігі, алынған донор қанымен үйлесуіне байланысты. Сондықтан, иммундау тәжірибесінде міндетті түрде реципиенттің иммунологиялық белсенділігімен донордың жақсы антидене түзу қасиетін ескеру керек. Мұның себебі әлі белгісіз. Қойлар қан топтарын зерттеу барысында антигендердің иммуногенді болуын 4 топқа бөлуге болатындығы анықталды: 1. Күшті антигендер - Аа және Аb (А-жүйесі), Вb (В-жүйесі) Са (С-жүйесі) 2. Орташа иммуногенді антигендер - Bg, Bi, Be (В-жүйесі), Сb (С-жүйесі) 3. Әлсіз антигендер-Bg, Bi, (B-жүйесі), Ма (М-жүйесі), Dа (D-жүйесі); 4. Табиғи антиденелер арқылы анықталатын R және O (R-жүйесі) антигендері. Экспериментальды жолмен жануарларды иммундау негізінде келесі нәтижелер алынған. Егер 1-ші топ антисарысуларды алу үшін 3-4 инъекция жеткілікті болса, 2-3-ші топ антигендеріне қарсы антиденелерді алу үшін 5-8, кейде 10 инъекция қажет (Марзанов Н.С.). Адъюванттарды қолдану арқылы иммундау. Әртүрлі жағдайда иммунизациялау антиденелер пайда болуын ынталандыруда маңызды орын алады. Мұндай иммуностимулярларға антигеннің өзіне әсер ететін, оның иммундығын күшейтетін немесе иммундық жауапқа қатысатын заттар жатады. Иммуногендердің пайда болуын ланолин мен вазелин майы қоспасы және вирулентті туберкулез бактериясы жасушаларымен өлтірілген заттар ең тиімді болып саналады (Фрейндтың толық адъюванты). Бұл адъювант көптеген антигендерге қатысты организмге сенсибилдік әсер етеді. Ланолиннің антиген жинағы ретінде әсер ету механизмі екі жақты: біріншіден ол антигенді тез бұзылудан сақтайды, екіншіден оның организмнен шығуын баяулатады. Яғни жануар организміне антигенді адъювант қоспасымен енгізу антигенді баяу соруға және сенсибилдік әсермен үйлестіру антидененің қарқынды және мол пайда болуына әкеледі. Адъювант 7,5 мл дозада бір рет бұлшықет ішіне енгізіледі. Енгізу алдында қоспа су моншасында (40оС дейін) жылытады. Адъювантты енгізу жануар иммунореактивтілігін 85% дейін, ал бұлшықет ішілік изоиммундау 30-50% арттырады. Жоғары титрі (1:32 және жоғары) сарысу беретін жануарлар саны 1,4-2 есе көбейеді. Фрейнд адъювантын қолдану поливалентті сарысу алуды үдетеді, бірақ титрдің жоғары және реципиент-қойларда әртүрлі сырқат болуына байланысты оларды өңдеу қиын болады (Марзанов Н.С.) Қойлардың жасына, жынысына, физиологиялық жынысына байланысты иммундаудың тиімділігі. П.И.Люцканов және Н.С.Марзанов (1989,1990) айтылған белгілердің әсерлерін толық зерттеді. Тұқым ішілік иммундауда (остфриз х остфриз) 46,2%, тұқым аралықта (цигай х остфриз) - 63,2% реактивті жануарлар болды. 12 айлық жануарлар арасында барлық иммундалғандардың 74,2% жоғары реактивті болды. Бір жылдық реципиенттерде төрт айлықтылыларға қарағанда реактивті жануарлар 27,6%-ға артық болды. Төрт айлық реципиенттерде максималды титр 1:64, 12 айлықтыларда - 1:256-ға жетті. Антидене түзілу үрдісінде антиген дозасына байланысты нақты заңдылық байқалмады. Жыныстар реактивтілігін зерттегенде ұрғашы дарақтар еркектерге қарағанда иммунологиялық белсенділігі жоғары екенін көрсетті. Осындай байқаулар спецификалық сарысулар алу үшін, жоғары иммунореактивтілігі бар сақа, қойларды қолдану тиімді екенін көрсетеді. Сақа жануарлар иммундауды жеңіл көтереді және олардан көп «шикі» сарысу алуға болады. Әр түрлі буаздылық кезеңінде қойларды иммундау ана мен қозы денсаулығына зиян келтірмейді. Қой қандары үшін қажетті консерванттар құрамы. Сарысу-реагент алу үшін иммундау және абсорбция жүргізгенде қан эритроциттерін ұзақ мерзімде сақтау маңызды. Ерітінді дайындаудың көп рецептілері болады. Қой қаны үшін консервант ретінде қолданылады: 1. натрий лимонды қышқылы 32г 40% нейтральды формалин 2 мл Тазартылған су 1000 мл 2. натрий лимонды қышқылы 30г Глюкоза 10г Сульфацеталин (альбуцид) 5г Риванол 0,05г Тазартылған су 1000 мг 3 натрий лимонды қышқылы 20г натрий хлориді 5г калий цианиді 0,5г Тазартылған су 1000 мл. рH 6,8-ден 7-ге жеткізу қажетті болғанда бірнеше кристалл аскорбин қышқылын, NaHPO4 қосылады. Айтылған консерванттардан басқа ешкі қанын сақтау үшін қан құю станцияларында «Глюгицир» өзін жақсы көрсетті. Ерітінділер ¼-1/5 арақатынасында қолданылады, олар тоңазытқышта 4ºС бір айға дейін сақталады. жүктеу/скачать 3,86 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|