Реферат Тақырыбы: днқ маркердің молекулярлық салмағы Орындаған: Қабылдаған: Жоспары
жүктеу/скачать 106,82 Kb.
|
stud.kz-105448
- Бұл бет үшін навигация:
- ПТР маркерлер
| 2.3.ДНҚ зонының маркерлері
RFLP (RFLP маркерлері, «шектеу фрагментінің полиморфизмінен»). Рестрикциялық ДНҚ үзінділерінің полиморфизмін бағалау әртүрлі тәсілдермен жүргізілуі мүмкін, бірақ ең дәстүрлі әдіс - бұл блот будандастыру). Бұл әдіске ДНҚ оқшаулау, рестрикциялық фрагменттерді алу, оларды электрофоретикалық бөлу, сүзгілерге беру, содан кейін алынған ДНҚ фрагменттерімен арнайы ДНҚ зондтарын будандастыру кіреді. ДНҚ зонды - бұл белгілі бір деңгейдегі гомологиясы бар және геномдық ДНҚ-ның сәйкес аймағымен будандастыру қабілеті бар клондалған ДНҚ-ның салыстырмалы түрде қысқа тізбегі. Рестрикциялық эндонуклеазалар мен зондтардың тіркесімдері әр адамға тән ДНҚ фрагменттерінің жоғары репродукцияланатын полиморфты спектрлерін береді. Соңғысының айырмашылығы, мысалы, шектеу орнын өзгертетін мутацияға байланысты болуы мүмкін. RFLP бірқатар маңызды артықшылықтарға ие, соның ішінде әртүрлі зертханалардағы спектрлердің жоғары репродуктивтілігі, маркердің кодоминантты «мінез-құлқы». RFLP көптеген биологиялық және экономикалық маңызды белгілер үшін геном карталарын жасауда, гендерді таңбалауда тиімді. VNTR (Variable Number Tandem Repeat) - ДНҚ саусақ ізі («саусақ іздері») деп аталатын әдіс. Тандемді қайталау әр түрлі геномдарда кең таралған және жоғары полиморфты. Осы ДНҚ аймақтарының жоғары өзгергіштігінің нәтижесінде микроэлементтер мен минисателлиттік реттілікке дейінгі зондтармен RFLP анализі популяция деңгейінде жоғары ажыратымдылықпен мультиокустық спектрлер алуға мүмкіндік береді. Полиморфизмнің өте жоғары деңгейіне байланысты бұл тәсіл қазіргі кезде популяция ішіндегі және популяциялар арасындағы өзгергіштікті талдауда және организмдер топтары арасындағы генетикалық арақашықтықты анықтауда жақсы құрал болып табылады. VNTR аллельді нұсқалары кодоминантты мұрагерлікке ие. ПТР маркерлер Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) әдісі нақты праймерлерді қолдануды және геномдық ДНҚ-ның жеке бөлімдерін күшейтудің дискретті ДНҚ өнімдерін өндіруді қамтиды. Байланысты технологиялардың үлкен саны осы қағидаға негізделген. Ең кең қолданылатын RAPD технологиясы ерікті нуклеотидтер тізбегі бар біртұтас праймерлерді қолданып, күшейтілген полиморфты ДНҚ фрагменттерін талдауға негізделген. SSR (Қарапайым тізбекті қайталау) - қысқа мини немесе микроспутниктік қайталануға жанама праймерлері бар ПТР кодоминантты тұқым қуалаушылық белгілерді идентификациялауға мүмкіндік береді және сәйкесінше берілген локус бойынша гетерозиготаларды анықтауға ыңғайлы. Алайда, ПТР-де қанаттарға арналған бір жұп праймер тек бір локустың полиморфизмін қарастыруға мүмкіндік береді. Көптеген микроспутниктік локустар үшін полиморфизмді анықтау мүмкін емес. Әдетте, берілген микроспутниктік локустың жанама тізбегі түрге тән. RAPD (кездейсоқ күшейтілген полиморфты ДНК) - ерікті нуклеотидтер тізбегі бар бір қысқа (әдетте 10 мүшелі) праймерді қолданатын полимеразды тізбекті реакция. Праймерлердің кезектілігі абсолютті ерікті емес, бірақ GC-құрамының 40-70% мәндерімен және 50-100% нуклеотидтер тізбегінің лингвистикалық күрделілігімен шектеледі. RAPD-де бір праймерді де, бірнеше RAPD праймерін де қолдануға болады. RAPD өнімі пайдаланылған төңкерілген праймерлік дәйектілікпен қоршалған геномдық ДНҚ фрагментін күшейту нәтижесінде пайда болады. Әдіс әр түрлі типтегі зерттеуге арналған, бір праймерді қолданған кезде әмбебап болып табылады. Әдетте, бір түрдегі жоғары полиморфизмді көрсететін праймер басқа түрлерде де тиімді болады. ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) - бұл RAPD әдісінің мамандандырылған нұсқасы, онда праймер микроспутниктік тізбектен тұрады. Бұл әдісте, RAPD сияқты, ұзындығы 15-24 нуклеотидтің бір немесе бірнеше праймерлері қолданылады. Бірақ бұл жағдайда праймерлер тандемдік қысқа 2-4 нуклеотидті қайталаулардан тұрады, мысалы, 5'-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA және праймердің 3 'ұшындағы бір немесе екі селективті нуклеотидтерден тұрады. ISSR күшейту өнімдерінде қапталдарда төңкерілген микроспутниктік астар тізбегі бар. Бұл әдісте праймер тізбегі ерекше және RAPD-ге қарағанда қатаң түрде таңдалғандықтан, ПТР-де күйдіруді RAPD әдісіне қарағанда жоғары температурада (55-60 ° C) жүргізуге болады, сондықтан саусақ ізі көбінесе жақсы ойнатылады. AFLP (ағылшынша күшейтілген фрагменттің ұзындығы полиморфизм) - RFLP және ПТР әдістерінің тіркесімі болып табылатын технология. AFLP - бұл бірнеше сатылардан тұратын күрделі әдіс: геномдық ДНҚ бір мезгілде екі рестрикменттік ферменттермен (EcoRI және MseI) қорытылады, олар сәйкесінше 4 және 6 негіздерді танып, 3 'ұштары шығыңқы бөлшектер шығарады. Содан кейін шектелген геномдық ДНҚ-ны шектеу орындары үшін жабысқақ ұштары бар адаптерге байлайды (EcoRI және MseI). Осыдан кейін қатарынан екі ПТР орындалады. Бірінші ПТР (преамплификация) EcoRI және MseI адаптерлерін толық толықтыратын праймерлерді қолданады. Бірінші ПТР-ден кейін EcoRI және MseI адаптерлерінің арасында күшейту өнімдерінің көп мөлшері пайда болады, оларды электрофорез арқылы ажырату қиын. Сондықтан, EcoRI және MseI адаптерлері бар екінші ПТР праймерлерінде 3'ұшында селективті күшейтуге арналған 1-ден 3-ке дейінгі адаптерлерге қосымша және комплементсіз болады. ДНҚ фрагменттерін бөлу сәйкесінше радиоактивті немесе люминесцентті затбелгісі бар полиакриламидті гельде орындалады. SSAP (ағылшынша тізбектің спецификалық күшейту полиморфизмі) - бұл транспозонның немесе ретротранспозонның геномдық ДНҚ-сына [нақтылау] полиморфизмді шектеу учаскесімен анықтауға арналған AFLP әдісінің модификациясы. Зерттелген үлгілердің геномдық ДНҚ-сы PstI және MseI рестриктоздық ферменттерімен бөлініп, 3 'ұштары шығып тұрған фрагменттер алынады. Содан кейін шектелген ДНҚ PstI және MseI адаптерлерімен байланыстырылады. Бірінші полимеразды тізбекті реакция (преамплификация) PstI және MseI адаптерлерінен алынған праймерлермен жүзеге асырылады, яғни шектелген геномдық ДНҚ-да осы адаптерлердің барлық мүмкін комбинациялары күшейтіледі. Бірінші ПТР-ден кейін праймерлер мен адаптерлер арасында локализацияланған ДНҚ фрагменттерінің күшейту өнімдерінің көп мөлшері пайда болады. ПТР өнімдері сұйылтылған және екінші, таңдамалы ПТР қолданылады. Екінші ПТР таңбаланған LTR праймерімен және кез келген PstI немесе MseI адаптер праймерімен орындалады. Екінші ПТР-да 3 'ұшында қосымша нуклеотидтері бар адаптерге праймерлер қолданылуы мүмкін, мысалы, адаптерге қосымша емес бір, екі немесе үш нуклеотид. Екінші ПТР-ден кейінгі электрофорез полиакриламидті гельде немесе флуоресцентті затбелгі қолданылған жағдайда секвенсорда жүргізіледі. Екінші ПТР-ден кейінгі күшейту өнімдері LTR ретротранспозон тізбегі мен адаптер арасындағы ДНҚ фрагментін күшейту нәтижесінде пайда болады. Негізінде тек LTR тізбектері арасында күшейту өнімдерін алуға болады, бірақ, әдетте, екі ретротранспозонның арақашықтығы әдетте алынған ПТР өнімдерінің өлшемдерінен үлкен (2500 - 3000 базалық жұп). Адаптерлер арасындағы күшейту өнімдері анықталмайды, өйткені жапсырма тек LTR праймерінде қолданылады. IRAP(Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism) - екі іргелес ЛТР ретротранспозондарының тізбектерін толықтыратын праймерлер арасындағы полимеразды тізбекті реакция. Әдістің бірнеше нұсқалары бар. IRAP-тің бірінші нұсқасында LTR-дан бір праймер қолданылады. Күшейту өнімі бірдей дәйектілікпен екі төңкерілген LTR арасында қалыптасады, яғни бір тізбекте бір LTR-дің 5'-шеті екінші LTR-дің 3'-ұшына бағытталған. Егер ретротранспозонның орталық бөлігі ПТР өнімдерінің әдеттегі өлшемінен ұзын болса (шамамен 3000 а.к.), онда ПТР тек әр түрлі ретротранспозициялардағы екі LTR арасында болады. Бұл жағдайда іргелес ЛТР-лар кері күйде болуы керек. IRAP-тің басқа нұсқасында төңкерілген ЛТР-ге екі түрлі праймер қолданылады: біреуі 5'-ұшынан, ал екіншісі РТР-дің 3'-ұшынан, ретротранспозоннан әр түрлі бағытта бағытталған. Бұл жағдайда іргелес LTR-лар тікелей ұзақ қайталаулар ретінде орналасады. Сонымен, IRAP-тің үшінші нұсқасында әр түрлі ретротрапозондардан әртүрлі бағдардағы LTR-ге праймерлер қолданылады. LTR-ден праймерді қайталанатын ДНҚ-дан басқа праймермен біріктіруге болады. REMAP (Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism) - ретротранспозон LTR фрагменті үшін праймер мен жақын жерде орналасқан микроспутниктің қайталануынан (ISSR праймері) жасалған праймер арасындағы полимеразды тізбекті реакция. Бұл жағдайда ретротранспозонның күшейтілген фрагментінің позициясы микроспутниктік локусқа праймер қолдану арқылы «якорь» болады. Мысалы, өсімдіктерде LTR праймерін және микроспутниктік праймерді (5'-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) праймердің 3'-ұшында жалғыз селективті нуклеотидпен қолдану ыңғайлы. REMAP LTR праймерлерінің варианттарын IRAP сияқты LTR-дің 5 'соңына және 3' ұшына дейін қолданады. RBIP (Retrotransposon-based Insertion Polymorphisms) - ретротрранспозон тізбектері үшін праймерлерді қолдануға негізделген және кодоминантты аллельді нұсқаларын анықтауға негізделген әдіс. Оның қағидаты мультиокустық ПТР-ге негізделген, ол ретро транспортацияға дейін ДНҚ аймағын қаптайтын екі праймерді және алғашқы екі праймердің арасына осы аймаққа енгізілген LTR ретротранспозонына арналған праймерді қолданады. ПТР нәтижесінде екі праймермен қоршалған фрагменттердің нұсқаларының бірі күшейтіледі, өйткені ЛТР арасындағы реттілік ішіндегі ретротранспозон бар геномдық ДНҚ учаскелері арасындағы ПТР үшін өте ұзақ. Бұл әдіс полиморфизмді тек берілген полиморфтық локус үшін анықтайды. Оның артықшылықтарына полиморфты нұсқалардың кодоминанттылығы, нүктелік дақтарды талдау үшін көптеген сорттарды қолдану мүмкіндігі жатады. iPBS (inter PBS amplification) - бұл PBS ретротранспозон тізбектері үшін праймерлерді қолдануға негізделген әдіс (Primer байланыстыру алаңы, tRNA байланыс орны). Әдіс сынамалар арасындағы полиморфизмді анықтауға, сондай-ақ эукариоттардағы жаңа ретротранспозондарды клондау үшін тиімді. Бір нуклеотидті полиморфизм (SNP). жүктеу/скачать 106,82 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|