Федеральное агентство по образованию

 
212
 
+
H
3
3
2
3
2
CH COCH + I
 CH COCH I + HI

 
При стехиометрических соотношениях реагентов скорость этой ре-
акции не зависит от концентрации иода. Наблюдается функциональная 
зависимость между наблюдаемой (эффективной) константой скорости и 
значением  константы  диссоциации  кислоты  вида: 
эф
a
n
k
K


.  Изучив 
экспериментальные данные, определите значения параметров 
n
 и 

. 
Кислота-катализатор 
K
a
 
k
эф
, дм
3
/(моль c) 
-хлорпропионовая 
1,01 · 10
–4
 5,9 
Уксусная 
1,75 · 10
–5
 2,4 
Пропионовая 
1,34 · 10
–5
 1,9 
Триметилуксусная 
9,10 · 10
–6
 1,7 
 

 
213
Г Л А В А   1 0 .   КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ 
РЕАКЦИЙ 
10.1.  ОЦЕНКА КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ 
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ 
Рассмотрим самую простую реакцию превращения субстрата (S) в 
продукт (Р) при участии фермента (Е). 
Уже  в  ранних  работах  было  обнаружено,  что  начальная  скорость 
ферментативной  реакции,  при  фиксированной  концентрации  фермента 
и малых концентрациях субстрата, изменяется линейно с концентрацией 
субстрата,  но  для  высоких  концентраций  субстрата  скорость  реакции 
уже не зависит от его концентрации. 
Л. Анри (1903 г.) первым предложил идею, что фермент образует с 
субстратом промежуточный комплекс. Развил эту идею Л. Михаэлис. 
Согласно  этой  идее,  механизм  процесса  можно  представить  со-
стоящим из двух стадий. Первая — обратимая и быстрая, вторая — не-
обратимая и медленная: 
 
1
2
1
E + S 
 ES 
 P + E
k
k
k




 
Для данного механизма скорость реакции определяется скоростью 
образования продукта реакции Р: 
 
P
2 ES
d
d
c
v
k c
t
 

. (10.1) 
Скорость образования промежуточного продукта ES равна: 
 
ES
1 S E
1 ES
2 ES
d
d
c
k c c
k c
k c
t




. (10.2) 
Уравнения материального баланса для фермента и субстрата имеют 
вид: 
 
0
E
E
ES
c
c
c


 и 
0
S
S
ES
c
c
c


, (10.3) 
где 
0
0
E
S
и
c
c
 — начальные  концентрации  фермента  и  субстрата; 
E
S
и
c
c
 —  их  текущие  концентрации; 
ES
c
 — концентрации  промежу-
точного соединения и продукта реакции. 

 
214
Решение системы  из трех уравнений (10.1)–(10.3) находим из сле-
дующих условий: 
1)  для 
0
t
 , 0
P
 , следовательно 
0
S
S
ES
c
c
c


; 
2)  обычно 
0
S
c
 >> 
0
E
c
, поэтому 
0
S
S
c
c
 ; 
3)  считают, 
что 
концентрация 
промежуточного 
соединения 
ES
c
стационарна  (на  основе  принципа  стационарности  Боденштейна), 
т. е. 
ES
d
0
d
c
t
 . 
Подставляя значение 
ES
c
 из (10.3) в (10.2) и решая его относитель-
но 
ES
c
при условии 
ES
d
0
d
c
t
 , получим: 
 
0 0
1 E S
ES
0
1 S
1
2
 
k c c
c
k c
k
k




. (10.4) 
Поделим  числитель  и  знаменатель  этого  уравнения  на 
1
k ,  тогда 
имеем: 
 
0 0
E S
ES
0
S
M
 
c c
c
c
K


. (10.5) 
Величину 
1
2
M
1
k
k
K
k



 принято называть константой Михаэлиса. 
Подставляя  уравнение (10.5) в (10.1), получим  уравнение  для  ско-
рости образования продукта в начальный момент времени: 
 
0 0
2 E S
0
0
S
M
 
k c c
v
c
K


. (10.6) 
Анализ  уравнения (10.6) позволяет  объяснить  наблюдаемые  на 
опыте закономерности:  
1) если 
0
S
M
c
K

, тогда  
 
0
0
2 E
0
S
M
 
k c
v
c
K

, (10.7) 

 
215
то есть начальная скорость линейно зависит от концентрации субстрата. 
Этот факт полностью подтверждается экспериментальными данными; 
2) если 
0
S
M
c
K

, тогда из уравнения (10.7) получаем: 
 
0
0
max
2 E
v
v
k c


, (10.8) 
то  есть  начальная  скорость  не  зависит  от  концентрации  субстрата,  что 
так  же  соответствует  опытным  данным.  Следовательно,  порядок  реак-
ции по субстрату в этом случае будет нулевой, а скорость процесса дос-
тигает максимального значения. Поэтому уравнение (10.6) можно запи-
сать в виде: 
 
0
max S
0
0
S
M
 
v c
v
c
K


. (10.9) 
Уравнение (10.9) в литературе известно как уравнение Михаэлиса–
Ментена. 
K
М
 называется константой Михаэлиса, физический смысл ко-
торой можно сформулировать, анализируя уравнение (10.9). 
Константа  Михаэлиса  численно  равна  концентрации  субстрата 
(
0
M
S
K
c

),  при  которой  активность  фермента  составляет  половину 
максимальной,  т. е. 
0
max
/ 2
v
v

,  и  имеет  размерность  концентрации, 
моль/дм
3
. Численные значения 
K
М
 обычно лежат в пределах 10
–2
–10
–8
 М, 
легко воспроизводятся и не зависят от концентрации фермента. В то же 
время 
K
М
  является  функцией  температуры,  рН  среды,  зависит  от  при-
сутствия других веществ, играющих роль ингибитора или активатора. 
Если для рассматриваемого механизма реакции выполняется усло-
вие 
1
k

 >> 
2
k ,  тогда 
1
M
S
1
k
K
K
k



,  где 
S
K  — субстратная  константа, 
т. е.  константа  диссоциации  фермент-субстратного  комплекса  на  фер-
мент  и  субстрат,  характеризующая  меру  связывания  фермента  с  суб-
стратом. В общем случае 
M
S
K
K

, причем экспериментальное значение 
M
K  представляет собой максимальное значение 
S
K . 
Только для ферментов разложения пероксида водорода, каталазы и 
пероксидазы,  для  которых 
1
k

 << 
2
k
,  константа  Михаэлиса 
M
2
1
/
K
k k

 
сильно отличается от субстратной константы 
S
K . 
Величину 
2
k
  (размерность  [
t
–1
])  называют  также  числом  оборотов 
фермента,  так  как  она  указывает  на  число  моль  субстрата,  превращен-
ных в продукт одним молем фермента в единицу времени. Для сложных 

 
216
реакций  константу 
2
k
  в  уравнении  Михаэлиса–Ментена  обычно  заме-
няют на 
кат
k  — каталитическую константу с той же размерностью. 
Для определения параметров 
M
K
 и 
max
v
 используют несколько спо-
собов лионеризации уравнения Михаэлиса–Ментена. 
Первый способ (способ Лайнуивера–Берка) 
Уравнение (10.9) приводят к виду: 
 
M
0
0
max
max
S
1
1
1
 
K
v
v
v
c



. (10.10) 
График прямой, построенной в координатах 
0
0
S
1
1
v
c

, отсекает отре-
зок  на  оси  ординат,  равный 
max
1
v
.  Тангенс  угла  наклона  прямой  равен 
M
max
K
v
. Константу 
M
K  можно определить по отрезку, отсекаемому прямой 
на оси абсцисс, так как при 
0
1
0
v
  имеем соотношение: 
 
M
0
max
max
S
1
1
 
K
v
v
c
 

,  
откуда  
 
0
M
S
K
c
  . 
Второй способ (вторая форма уравнения Лайнуивера–Берка) 
Уравнение (10.10) умножают на 
0
S
c
: 
 
0
0
S
M
S
0
max
max
1
c
K
c
v
v
v


. (10.11) 

 
217
График  в  координатах 
0
S
0
c
v
–
0
S
c
  представляет  собой  также  прямую, 
отсекающую на оси ординат отрезок, равный 
M
max
K
v
, а на оси абсцисс — 
отрезок, равный 
M
K . 
Третий способ (способ Эдди–Хофсти) 
Если умножить обе части уравнения (10.10) на (
max 0
v v
), то оно при-
водится к виду: 
 
0
0
max
M
0
S
v
v
v
K
c


. (10.12) 
График,  построенный  в  координатах 
0
0
0
S
v
v
c

,  дает  прямую  линию, 
тангенс угла наклона, которой равен 
M
K
, а отрезок, отсекаемый на оси 
ординат,  равен 
max
v
.  Кроме  того,  отрезок,  отсекаемый  на  оси  абсцисс, 
равен 
max
M
v
K
, так как при 
0
0
v
  
0
max
M
0
S
v
v
K
c

 или 
max
0
0
M
S
v
v
K
c

. 
Указанные  способы  лианиризации  уравнения  Михаэлиса–Ментена 
охватывают различные области концентрации субстрата, когда возмож-
ны отклонения от линейности. Поэтому полезно значения 
M
max
и
K
v
, оп-
ределенные различными способами, сравнивать между собой. 
Нетрудно показать, что аналогичная (10.9) форма уравнения может 
быть  получена  и  для  более  сложных  механизмов  реакции.  Например, 
когда субстрат взаимодействует с ферментом по схеме: 
 
1
3
2
1
1
E + S 
 ES 
 ES + X 
 E + Y
k
k
k
k





 
Выражение для начальной скорости имеет вид: 
 
0 0
2
E S
0
0
M
S
 
k c c
v
K
c




, (10.13) 
где 
3
2
3
k
k
k



. Это уравнение аналогично по форме уравнению Миха-
элиса–Ментена и также легко линеаризуется.  

 
218
Возможно  протекание  более  сложных  ферментативных  реакций  с 
участием двух субстратов. 
10.2.  ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ НА КИНЕТИКУ 
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ 
Вещества,  присутствие  которых  в  системе  понижает  актив-
ность  фермента,  то  есть  уменьшает  скорость  реакции,  называ-
ются ингибиторами. 
Эффект ингибирования может происходить по разным причинам. 
1.  Ингибитор I конкурирует  с  субстратом  за  активный  центр,  так  как 
по  строению  близок  к  нему  и  является  псевдосупстратом,  образуя  с 
ферментом неактивный комплекс:  
 
1
1
E + I 
 EI
k
k



 
Константа диссоциации комплекса ЕI называется константой инги-
бирования: 
 
E I
I
EI
c c
K
c

. 
Начальная  скорость  реакции  в  присутствии  ингибитора  всегда 
меньше, чем при его отсутствии. 
Если  при  увеличении  концентрации  субстрата  в  растворе  актив-
ность  фермента  восстанавливается,  такое  ингибирование  назы-
вается конкурентным. 
Предельное  значение  скорости  не  зависит  от  присутствия  ингиби-
тора: 
 
0
max
2 E
v
k c

. 
Уравнение  Михаэлиса–Ментена  в  присутствии  ингибитора  в  этом 
случае имеет вид: 
 
0
max S
0
0
S
M,эф
 
v c
v
c
K


, (10.14) 

 
219
где  
 
0
I
M,эф
M
I
1
c
K
K
K








 — 
(10.15) 
эффективная константа, зависящая от 
0
I
c
 и 
I
K
. 
Если 
0
I
I
c
K

 и 
0
S
M
c
K

, то скорость реакции ингибирования будет 
равна 
max
/ 3
v
. 
Выражение для константы ингибирования выразим из (10.15): 
 
0
I
I
M,эф
M
/
1
c
K
K
K


. (10.16) 
Таким  образом,  для  определения 
K
I
,  кроме 
0
I
c
,необходимо  знать 
эффективную константу реакции в присутствии ингибитора и константу 
Михаэлиса — в его отсутствие. 
M,эф
M
и
K
K
 можно найти, решая задачу 
графическим  методом,  например,  в  координатах  Лайнуивера–Берга: 
0
0
S
1
1
v
c

, для случая протекания процесса с ингибитором и без ингибито-
ра.  Константу  ингибирования  можно  рассчитать  по  уравнению (10.16) 
или определить непосредственно из графика, так как отношение танген-
сов  угла  наклона  прямых  в  точке  пересечения  с  осью  ординат  равно 
0
I
I
1
c
K







. 
2.  Ингибитор не конкурирует с субстратом за активный центр, так как 
присоединяется  к  другой  части  молекулы  белка  с  образованием 
неактивных комплексов (EI и ESI), имеющих константы равновесия: 
 
E I
I
EI
c c
K
c

, 
ES I
ESI
c c
K
c
 
 (10.17) 
Наличие ингибитора в этом случае приводит к снижению активно-
сти фермента, но не изменяет его сродство к субстрату.  
Если  достигается  обратимость  ингибирования,  то  есть  восста-
новление активности фермента под действием отличных от суб-
страта  веществ,  такое  ингибирование  называется  неконкурент-
ным.  

 
220
Если оба комплекса (EI и ESI) неактивны, то есть не дают продук-
та,  а  константы  их  диссоциации  близки  между  собой  (
I
K
K

),  то  это 
равносильно  дополнительному  условию:  ингибитор  не  мешает  взаимо-
действию субстрата с ферментом, но уменьшает скорость реакции из-за 
неактивности образующихся комплексов на поверхности фермента. 
В  этом  случае  константа  Михаэлиса  остается  постоянной  величи-
ной, а изменяется максимальная скорость процесса: 
 
max
max,эф
0
I
I
1
v
v
c
K


. (10.18) 
Уравнение Михаэлиса–Ментена в этом случае запишется как 
 
0
max,эф S
0
0
S
M
 
v
c
v
c
K


. (10.19) 
Если 
0
I
I
c
K

 и 
0
S
M
c
K

, то скорость реакции ингибирования будет 
равна 
max
/ 4
v
. 
Выражение для константы ингибирования получим из (10.18): 
 
0
I
I
max
max,эф
/
1
c
K
v
v


. (10.20) 
Линеаризация  уравнения (10.19) и  обработка  экспериментальных 
данных для неконкурентного ингибирования в координатах 
0
0
S
1
1
v
c

 по-
зволяет определить 
M
max
max,эф
I
,
,
и
K v
v
K , зная 
0
I
c . 
3.  При  бесконкурентном  ингибировании  образуется  один  неактивиро-
ванный комплекс (ESI) с константой равновесия  
 
ES I
ESI
c c
K
c
 
. (10.21) 
Уравнение Михаэлиса–Ментена в этом случае запишется как 
 
0
max,эф S
0
0
S
M ,эф
 
v
c
v
c
K


, (10.22) 

 
221
где  
 
M
M,эф
0
I
I
1
K
K
c
K


. (10.23) 
В этом  случае эффективная  константа отличается от  значения для 
конкурентного  ингибирования,  но  эффективная  скорость  выражается 
уравнением, аналогичным для неконкурентного ингибирования. 
Линеаризация  уравнения (10.22) и  обработка  экспериментальных 
данных для неконкурентного ингибирования в координатах 
0
0
S
1
1
v
c

 по-
зволяет определить 
M
M,эф
max
max,эф
I
,
,
,
 и
K
K
v
v
K , зная с
I
0
. 
10.3.  ПРИМЕРЫ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ 
Пример 1. 
Рассчитайте  значение  константы  Михаэлиса  и  значение 
максимальной  скорости  (
M
K   и 
max
v
)  всеми  возможными  методами  для 
реакции  гидролиза  метилового  эфира N-бензоил-L-аминомасляной, 
катализируемого 
-химотрипсином.  Известны  данные  о  зависимости 
начальной скорости от концентрации субстрата: 
0
S
 
c ·10
3
, М 
2,24 2,24 1,49 1,49 1,12 1,12 0,90 0,90 0,75 0,75
0
v
 · 10
7
, моль/с 
4,25 4,31 3,52 3,60 3,10 3,12 2,71 2,77 2,45 2,40
Р е ш е н и е .   Для  графического  решения  преобразуем  уравнение 
Михаэлиса–Ментена в линейную форму. 
1-й способ Лайнуивера–Берка 
Уравнение приводится к виду: 
 
M
0
0
max
max
S
1
1
1
 
K
v
v
v
c


. 
Рассчитанные значения 
0
S
1
c
, 
0
1
v
 заносим в таблицу и строим график 
в соответствующих координатах. 

 
222
0
S
1
c  · 10
–2
, М
–1
 
4,46 4,46 6,71 6,71 8,93 8,93 11,11 11,11 13,33 13,33
0
1 v
 · 10
–6
, с/моль  2,35 
2,32 2,84 2,78 3,23 3,21 3,69 3,61 4,08 4,17 
 
0
4
8
12
16
1
2
3
4
5
1/
v
0
 · 1
0
6
, c
/мо
ль
1/c
S
0
 · 10
2
, M
1
 
 
Отрезок  на  оси  ординат  получается  равным 1/v
max
 = 1,45 · 10
6
,  по-
этому v
max
 = 1/(1,45 · 10
6
) = 6,9 · 10
–7
 моль/с. 
Тангенс  угла  наклона  прямой  равен tg 

 = 2000,  следовательно 
K
М
 = tg 

 · v
max
 = 2000 · 6,9 · 10
–7
 = 1,38 · 10
–3
 М. 
2-й способ Лайнуивера–Берка 
Строят график по уравнению  
 
0
0
S
M
S
0
max
max
1
+ 
c
K
c
v
v
v

 
в координатах 
0
S
0
c
v
–
0
S
c . 
0
S
c 10
3
, М 
2,24 2,24 1,49 1,49 1,12 1,12 0,90 0,90 0,75 0,75
0
S
0
c v  · 10
–3
, с/моль 
5,27 5,20 4,23 4,14 3,61 3,59 3,32 3,25 3,06 3,13
 

 
223
-2
-1
0
1
2
3
2
4
6
c
S
0
 ·10
3
, M
c
S
0
/v
0
 ·10
3
, c/дм
3
 
 
Из  графика  получается,  что  прямая  отсекает  на  оси  ординат  отре-
зок,  равный 
M
max
K
v
= 2 · 10
3
,  а  на  оси  абсцисс  отрезок,  равный  K
М
 =  
= –1,38 · 10
–3
.  Поэтому  K
М
 = 1,38 · 10
–3
 М,  v
max
 = 1,38 · 10
–3
/(2 · 10
3
) = 
= 6,9 · 10
–7
 моль/с. 
Способ Эдди–Хофсти 
Уравнение приводится к виду 
0
0
max
M 0
S
v
v
K v c


. 
Строится график в координатах v
0
–
0
0
S
v c . 
0
0
S
v c  · 10
4
, дм
3
/с 
1,90 1,92 2,36 2,42 2,77 2,79 3,01 3,08 3,27 3,20
v
0
 · 10
–7
, с/моль 
4,25 4,31 3,52 3,60 3,10 3,12 2,71 2,77 2,45 2,40
 
0
1
2
3
4
5
0
2
4
6
8
v
0
/c
S
0
 · 10
4
, дм
3
/c 
v
0
 · 
1
0
7
, мол
ь/
с
 
 

 
224
График  дает  прямую  линию,  тангенс  угла  которой  равен  
–1,36 · 10
–3
, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 6,86 · 10
–3
. По-
этому K
М
 = 1,36 · 10
–3
 М, v
max
 = 6,86 · 10
–3
 моль/с. 

жүктеу/скачать 1,59 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: