C. jejuni.
Материалы и методы. В работе были использованы рекомбинантные антигены C.
jejuni МОМР32 и ОМР18 полученные в лаборатории иммунохимии ТОО «Националь-
ный центр биотехнологии» МЗ РК, полный и неполный адъюванты Фрейда, забуферен-
ный физиологический раствор (ЗФР), мыши линии Balb/c, миеломная линия клеток
Х63Ag8.653, ПЭГ 4000, среда для культивирования RPMI 1640 Medium (Sigma-aldrich),
фетальная сыворотка плода (ThermoScientific).
Гибридизацию клеток миелом с клетками иммунных спленоцитов проводили по ме-
тоду Oi V. & Herzenberg L. [9]. Тестирование культуральной жидкости проводили мето-
дом непрямого варианта ИФА.
Иммунизацию линейных мышей проводилипутем внутрибрюшинного введения ан-
тигенов в дозе 0,1мл на голову с концентрацией белка 25 мкг/мл. Иммунизацию мышей
проводили по короткой схеме, включающей в себя пятикратное парентеральное введение
препарата с полным и неполным адъювантами Фрейда в 1 и 7 день иммунизации соот-
ветственно и с забуференным физиологическим раствором на 11, 12, и 13 дни иммуни-
зации. На 17-ый день после начала иммунизации проводили отбор сывороток крови для
тестирования.
Тестирование в иммуноферментном анализе проводили по стандартной методике.
Сенсибилизацию лунок планшетов проводили рекомбинатными белками МОМР32 и
ОМР18 в концентрации 0,001 мг/мл и инкубировали в течение 14 часов при 4℃. По
результатам тестирования было выявлено, что в ответ на введение рекомбинантных бел-
ков в организме у подопытных животных выработались антитела заданной специфично-
сти. При этом максимальные титры специфических антител составляли 1:25 600 и 1:12
800, соответственно. Высокие титры антител у иммунизированных животных позволи-
ли начать работу по гибридизации иммунных спленоцитов с миеломной линей клеток
Х63Ag8.653.
Выделение иммунных спленоцитов проводили в условиях ламинарного бокса, пу-
тем вымывания В-лимфоцитов методом перфузии из селезенки иммунизированных
мышей. Подсчет клеток производили в камере Горяева.
Клетки миелом Х63Ag8.653 извлекали из жидкого азота, размораживали, культивиро-
вали на питательной среде, затем смывали со дна культурального матраца и подсчитыва-
ли в камере Горяева.
Гибридизацию (слияние) клеток миелом и В-лимфоцитов проводили в присутствии
ПЭГ 4000, соотношение клеток составляло 1:10 соответственно. После гибридизации
194
суспензию клеток по 0,1 мл разносили в лунки 96-ти луночных планшет для культиви-
рования. Лунки планшетов предварительно покрывали клетками перитонеальных макро-
фагов, которые являются питающим слоем. Планшеты помещали в СО2-инкубатор с по-
стоянным присутствием 5 % углекислого газа при температуре 37℃. Через 24 часа после
гибридизации вносили селективную среду «HAT» (Sigma), на 7 сутки проводили замену
селективной среды на «НТ».
Скрининг роста гибридных клеток и определение их физиологического состояния
осуществляли путем ежедневного просмотра планшетов под инвертированным микро-
скопом «
Micros
» рисунок 1.
Рисунок 1 – Скрининг роста гибридных клеток
В результате просмотра под микроскопом, на 10 день после проведения гибридизации
было обнаружено пять гибридных клонов. Далее, в более поздние сроки, клоны продол-
жали появляться, максимальное количество клонов было зафиксировано на 19-е сутки.
Динамика клонообразования в зависимости от срока культивирования представлена в
таблице 1.
Таблица 1 – Динамика клонообразования в зависимости от сроков культивирования
Количество суток после
гибридизации
Выход клонов, %
Количество клонов
% - от общего количества
10-е сутки
5
1,3
15-е сутки
37
9,6
19-е сутки
63
16,4
Культуральную жидкость из лунок, в которых зафиксирован рост гибридных клеток,
тестировали в ИФА на наличие специфических антител к исходному антигену. В лунки
планшетов, из которых была отобрана культуральная среда для тестирования, добавляли
равное количество полной ростовой среды. Далее культивирование клеток проводили
только на полной ростовой среде, включающей в свой состав 10%-ную фетальную сы-
воротку. Тестирование гибридом на антительную продуктивность начинали проводить,
когда наблюдалось незначительное пожелтение ростовой среды и клетки гибридом за-
нимали более 30% поверхности лунок планшета.
Всего на 19-е сутки было выявлено 63 гибридных клона, что составляет 16,4% от
общего количества потенциально возможного образования клонов. При тестировании
выявлено восемнадцать гибридных клонов, продуцирующих специфические иммуногло-
булины к рекомбинантным белкам МОМР 32 (4,7%).
Таким образом, в результате слияния клеток Х63Ag8.653 с клетками иммунных спле-
ноцитов мышей, получено 18 гибридных клонов, продуцирующих специфические имму-
ноглобулины к рекомбинантным белкам МОМР 32. Проведен отбор и культивирование
положительных клонов.
195
Достарыңызбен бөлісу: |