Өсімдік қорғаудағы биотехнология

49 

 

 

Зертханалық –тәжірибелік сабақтар 

 

№ 1 зертханалық – тәжірибелік сабақ 

Тақырыбы: Картоп вирустарымен тест-ӛсімдіктерді инокуляциялау. 

 

Сабаққа қажетті құрал жабдықтар: мақта, мәрлі, тамызғыштар 

(автоматты  дозаторлар),  инфекциялық  шырын,  зақымдалған  ӛсімдік 

немесе PVY вирусты препараты, карборунд, петри табақшалары, шыны 

тҥтіктер, Nicotiana tabacum темекі ӛсімдігі. 

Жұмыстың  барысы:  Картоптың  Y  вирусын  жинақтаушы  ретінде 

Samsun  сортының  Nicotiana  tabacum  ӛсімдігі,  картоптың  М-вирусын 

жинақтаушы  томаттың  «Колхозница»  және  «Невский»  сорттарының 

ӛсімдіктері. 

Инокуляцияға арналған ӛсімдік жапырақтарына аздаған карборунд 

ҧнтағын  себелейді. Одан кейін ӛсімдік жапырағының ҥстіңгі бетіне жай 

ғана  саусақ  ҧшымен    немесе  паролонды  губкамен  ҥйкелеп,  жҧқарған 

жерге  инокулюм  ерітіндісін  енгізеді,  яғни    пластинка  бойымен  жағып 

шығады.  Инокуляция  жасағаннан  кейін  жапырақты  пульверизатор 

арқылы  таза  сумен  жуады.  Ӛсімдік  инокуляциясы  бір  тәулік  уақыт 

жҥреді, ал одан кейін оны жарық бетіне шығарып қояды.14-18 тәулікте 

инокуляцияланған  ӛсімдіктерді  вирусты  тестілеу  анықтау  тәсілдерінің 

бірі    тамшылы  агглютинация  әдісі  (КА)  және  иммуноферментті  анализ 

әдісімен  анықтайды.  Одан  кейін  вирустың  зақымдалу  барысын 

қадағалайды.Әр кӛрсеткішті кестеге енгізіп отырады. 

 

1-      Кесте.  Картоп  ӛсімдігінің  вирустармен  зақымдалуын  тест  әдісімен 

бағалау 

Тест 

ӛсімд

ік 

Тест 

ӛсімд

ік 

Картопт

ың 

вирусы 

КА 

ИФА 

Залалд

ану 

белгіле

рі 

14 

тәулікт

ен 

кейін 

28 

тәулікт

ен 

кейін 

14 

тәулікт

ен 

кейін 

28 

тәулікт

ен 

кейін 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

50 

 

№ 2-3 зертханалық – тәжірибелік сабақ 

Тақырыбы: Ӛсімдіктің зақымдалуын есептеу әдістері. 

Иммуноферменттік талдау әдісі. 

 

Мазмҧны:  Буферлік  ерітінділерді  дайындау.  Ӛсімдік  ҥлгілерін 

дайындау. ИФТ – ды жҥргізу («сэндвич-нҧсқа  ИФТ»).   

Сабаққа  қажетті  құрал  жабдықтар:картоп  вирустарын  анықтауға 

арналған диагностикалық жиынтық, полистирол планшеттер, автоматты 

дозаторлар  (бір-  және  сегізканалды),  спектрофотометр,  сҥзгі  қағаз, 

ӛсімдік  жадығаты    (картоп  тҥйнектері,  жапырақ,  пробиркалық 

ӛсімдіктер). 

Тапсырманың қысқаша мазмұны: 

Иммуноферменттік талдау негізінде картоп ӛсімдігінің 

диагностикасы картоптың әр тҥрлі вирустарының сезімталдығын 1-10 нг 

вирус/мл анықтауға мҥмкіндік береді. 

Қос антидене әдісінің принципі («сэндвич-нҧсқа  ИФТ») 

иммобильденген қатты фазадағы спецификалық антивирусты 

иммуноглобулиндермен  антигенмен және иммуноглобулиндермен 

кешеннің  тҥзілуі,  ферменттің субстратты реакциядағы фермент-

маркердің кезегімен анықталуымен тҥйінделеді. 

Жұмыстың әдістемесі және орындалу барысы: 

Буфер ерітінділерін дайындау 

Буфер  ерітінділерін  дайындау  картоп  вирусын  анықтауға  арналған 

диагностикалық  жиынтықтың  әдістемелік  нҧсқаулығына  сәйкес  келесі 

кезекпен жҥргізіледі: 

1. 

Жабын буферін дайындау; 

2. 

Антидененің жҧмыс ертіндісін дайындау; 

3. 

Жуу ертіндісін дайындау; 

4. 

Ҥлгі коньюгат буферін дайындау; 

5. 

Коньюгат жҧмыс ертіндісін дайындау; 

6. 

Субстрат буферін дайындау; 

7. 

Стоп-реагентті дайындау; 

Ӛсімдік ҥлгілерін дайындау 

Ӛсімдік материалын (пробиркадағы ӛсімдік, ӛскіндер, тҥйнектер, картоп 

ӛсімдігінің жапырағы invivo-да ӛсірілген) мына есеппен ӛлшейді: 0,1 гр 

ҥлгіні  1  мл  сынама-коньюгат  буферіне.  Сынаманы  қолмен  фарфорлы 

ыдыста  келсаппенгомогендейді.  Кейін  100  мкл-ден  полистиролды 

планшеттердің ойықтарына енгізеді. 

Иммуноферменттік талдауды жҥргізу.   

- Х-, S-, М-, Y-, А-, L- вирустарына  сәйкес иммуноглобулиндердің 

полистиролды платтарының сенсибилизациясы. 

- 37



С температурадағы термостатта 2 сағат бойы инкубациялау;  

-  Плат  ойықтарындағы  антидене  қалдықтарын  жууға  арналған 

51 

 

буфер ертіндісімен 2 рет твин – 20 қосылған сумен (детергент) тазалау,  

1  рет  –  жиынтықтағы  жуу  буферімен    (1  флакон  жуатын  буфер  2  литр 

дистилденгенсумен);   

- Қҧрамында вирусы бар немесе тестіленген ҥлгіні (антигенді) плат 

ойықтарына жҧқтыру; 

-  Антигенді  10-14  сағат  бойы  4



С-тық  тоңазытқыш  камерада 

инкубациялау;  

- 

Байланыспаған 

антигендерді 

жууға 

арналған 

буферлі 

ертінділермен ойықтарды тазалау арқылы жою;   

-  Х-,S-,М-,Y-,А-,L  вирустарына  қарсы  коньюгат  етінділерін  енгізу 

(меченді ферментті антидене); 

- 37



С температурадағы термостатта 1 сағат бойы инкубациялау; 

- жууға арналған буферлі ертінділермен ойықтарды тазалау арқылы  

коньюгаттарды жою;   

- субстрат енгізу; 

-  реакцияны  тоқтату  –стоп-реагент  енгізу.  20%  кҥкірт  қышқылы 

ертіндісін әр ойыққа 50 мкл-ден енгізу;  

- спектрофотометрде немесе визуалды тҥрде талдау нәтижесін 

санау. 

 

Бақылау сҧрақтары 

1. 

ИФТ жҥргізу ҥшін қандай ертінділер қажет 

2. 

Тестілеу ҥшін қандай ӛсімдік жадығаты жарамды? 

3. 

Вирустасымалдаушылыққа  тестілеу  ҥшін  ӛсімдік  ҥлгілерін 

қалай дайындайды? 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

52 

 

№ 4-5 зертханалық – тәжірибелік сабақ 

Тақырыбы:Ӛсімдіктің зақымдалуын есептеу тәсілдері 

 

Тапсырманың қысқаша мазмұны: Агглютинация  (лат. agglutinatio 

— склеивание - жабысу) — қоректік ортадағы корпускулярлы 

бӛлшектердің бактерия, эритроциттер, лейкоциттер, тромбоциттер, 

клетка ҧлпалары, антиген және антиденелермен адсорбцияланған 

химиялық активті бӛлшектердің тҧнуы және жабысуы.  

Реакция  тудыратын  антиденені  агглютиндер,  ал  реакцияға 

қатысатын  антигендерді  агглютиногендер  деп  атайды.  Агглютиндерді 

негізінде  реакцияға  алынған  клеткаға  сәйкес  атайды.  Реакция  қан 

сарысуындағы антиденені, инфекциялық ауруы бар ағзадағы секреттерді 

табуға  мҥмкіндік  береді.  Реакция  А  спецификалық,  спецификалы  емес 

және кездейсоқ болуы мҥмкін.  

Спецификалы А. тҥрлі антигендермен иммундалған жануар немесе 

адам сарысуының әсерінен туындайды. 

 

Жұмыстың әлістемесі және орындалу барысы: 

Реакция  пробиркаларда,  ойығы  бар  шыныларда  немесе  ойықтары 

бар  пласттарда  жҥргізіледі.  Бҧл  әдісті  қолданғанда  диагностикалық 

сарысу  тамшыларын  зерттеуге  алынған  ҥлгінің  шырыны  тамшысымен 

араластырады.  Осы  араласқан  тамшыда  пайда  болған  ҥлпектердің 

кӛрінісінен серологиялық реакцияны кӛруге болады.  

Агглютинация реакциясы келесі кезекпен бағаланады:  

+ + + + толық агглютинация, сҧйықтық мӛлдір, культура тҧнбада 

болады;  

+ + + толық емесагглютинация,  сҧйықтық аса мӛлдіремес, тҧнба бар;  

+ + әлсіз агглютинация, сҧйықтық  мӛлдіремес, тҧнба бар; 

+ агглютинация іздері болады, сҧйықтық  мӛлдіремес, шамалы тҧнба 

болады;  

—кері реакция, барлық пробиркадағы ӛлшем біркелкі мӛлдір емес, 

тҧнба болмайды.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

53 

 

 

№ 6-8 зертханалық – тәжірибелік сабақ 

Тақырыбы: Темекі ӛсімдігінен каллус индукциялау. 

 

Қажетті  құрал-жабдықтар:  Химиялықстакан    1  л  (4  дана.), 

тығындар  ( 1  л  - 1 дана.,    100  мл  - 2 дана.), пенициллин ыдыстары  (10 

дана.),  ӛлшегіш  тамызғыштар  (10  және  1  мл),  аналитикалық  таразы, 

торсион таразысы, электроплита, химреактивтер. 

Тапсырманың қысқаша мазмұны:Картоптың каллус ҧлпасын 

тҥйнек паренхимасынан, жапырақтан, қалемшеден және тамырдан  алуға 

болады. Каллус алу ҥшін залалсыздандырылған пробиркадағы ӛсімдікті  

немесе залалсыздандырылмаған мҥшелерді алса да болады.  

Жұмыстың барысы: 

1  л  химиялық  стақанға  30  г  сахароза  салып  ҥстінен  жартылай 

дистильденген  су  қҧяды  да  қыздыра  отырып  ерітеді.  Оған  қажетті 

микро-макро  элементтер,  дәрумендер  мен  фитогармондарды  қосады. 

Егер  рН  мӛлшерде  болмаса,  оны  0,1Н  ертіндісі  немесе  НCl  ертіндісін 

тамшылата отырып қажетті деңгейге жеткізеді. 

Агар-агарды  (7  гр)  ҥстіне  су  қҧйып  химиялық  стақанда  қыздыру 

арқылы  ерітеді.  Агар  толықтай  ерігеннен  кейін  ҥстіне  макро-,  микро 

элементтері,  сахароза,  дәрумендер  және  фитогармондары  бар 

сҧйықтықты  қҧяды  да  1  литрлік  цилиндрге  қҧйып,  қажетті  деңгейге 

дейін  жеткізеді.  Дайын  қоректік  ортаны  250  мл-к  колбаларға  қҧйып, 

мақталы-мәрлілі тығындармен жауып автоклавта залалсыздандырады.  

Томат ӛсімдігінен каллус индукциялауға арналған қоректік ортаның 

қҧрамы:  



 

макротҧздар (КNO

3

  38  г/л;  CaCl

2

  8,8  г/л;  NH

4

NO

3

  33  г/л,  немесе  CaCl

2

  . 

2H

2

O 13,8 г/л; MgSO

4

 3,6 г/л, немесеMgSO

4 

.7H

2

O 7,4 г/л; KH

2

PO

4

 3,4 г/л) 

– 50 мл/л;  



 

микротҧздар  (H

3

PO

4

  620  мг/100  мл  ;  MnSO

4 

.  4H

2

O  2230  мг/100  мл; 

ZnSO

4 

860  мг/100  мл;  Kl  83  мг/100  мл;  Na

2

MoCl

4

  .  2H

2

O  25  мг/100  мл; 

CuSO

4

 . 5H

2

O 2,5 мг/100 мл; CoCl

2

 . 6H

2

O 2,5 мг/100 мл) – 1мл/л; 



  Fe-хелат  (FeSO

4

  .7H

2

O 557 мг/100 мл; ЭДТА-Na

2

  (трилон  Б)  745  мг/100 

мл) – 5 мл/л;  



 

мезоинозит – 100 мг/л; 



 

глицин – 2 мг/л; 



 

никотин қышқылы (РР) – 0,5 мг/л; 



 

пиридоксин (В

6

)– 0,5 мг/л; 



 

тиамин (В

1

)– 1 мг/л; 



 

сахароза – 20 г/л;  



  2,4-Д – 0,5 мг/л; 



 

ИСҚ – 1 мг/л; 



 

кинетин – 2 мг/л;  

54 

 



 

агар – 7 г/л.  



 

рН – 5,7. 

 

20-25 кҥнгі инокуляциядан темекінің жас жапырақтарын жеке алып, 

дистильденген  сумен  бірнеше  қайтара  жуып  залалсыздандырады. 

Залалсыздандыру 20% этанолда (1 мин), 5% - хлорлы извест ертіндісінде  

(15  мин)  және  5%  -  хлорамин  ертіндісінде  (20  мин)  жҥргізіледі. 

Жапырақтарды  дистильденген  сумен  бірнеше  қайтара  жуып,  мӛлшері 

0,5-0,7  мм  болатын  тӛртбҧрышты  бӛліктерге  бӛледі.  Экспланттарды 

Петри  табақшасындағы  қоректік  ортаға  орналастырады.  Каллус  жақсы 

тҥзілу  ҥшін  эксплантты  бірнеше  жерден  тесіп  жарақаттайды.Каллусты 

алғашқы кезеңде 1500 лк-к  жарықта ҧстайды.   

Екі апта ӛткеннен кейін нәтижесін қарап, дәптерге жазады.  

 

жүктеу/скачать 1,75 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: