Сандық цитохимия әдістері
ДНҚны Фельген әдісі арқылы анықтау
жүктеу/скачать 68,84 Kb.
|
Дәріс 1-15 Сандық цитохимия әдістері
| ДНҚны Фельген әдісі арқылы анықтау.
Әдіс ДНҚ молекуласын ыдырататын өнімдердің түссіз фуксинкүкірт қышқылымен әрекеттесе отыра (Шифф реактиві) қызылкүрең (пурпурный) түске ие кешен түзеді. Осындай жолмен, гистохимиялық реакцияның өнімінің локализациясы ДНҚның орналасуын анықтайды, ал боялу деңгейі – оның концентрациясын. Ерітінділерді дайындау. Шифф реактиві. Негіздік фуксиннің 1 г 200 мл қайнап жатқан дистилденген суға ерітеді және, ерітінідісі бар ыдысты шайқай отыра, 5 мин қайнатады. Сосын ішіндегі сұйықтықты 500С дейін суытып, ерітіндіні сүзеді, 10 мл 1N HCl ерітіндісін қосып, 250С дейін суытады, осыдан соң 1 г натрий (Na2 S2 O5) немесе калий (K2 S2 O5)метабисульфитін қосып, қараңғыда қалдырады. 18-24 сағ кейін ерітіндіге 2 г белсендірілген көмір себеді, 1 мин шайқайды, сүзіп, 0-40С температурада қараңғыда сақтайды. Шиффтің дайын реактиві түссіз немесе ашық сары түске ие. Ерітіндінің қызаруы оның ыдырауы мен қолданысқа жарамсыздығы туралы айтады. Есте сақтайтын жәйт, кейде сатылымға толық емес тазаланған негіздік фуксин түседі. Сондықтан, егер дайындалған ерітінді қойылған талаптарға сай келмесе, жаңа партиядан негіздік фуксинді алып, қайта реактив дайындау керек. Бірнормальді хлорсутек қышқылының ерітіндісі. 10 мл концентрленген хлорсутек қышқылына (тығыздығы 1,19) 90 мл дистилденген су қосады. Ерітінді ұзақ уақыт сақталады. Кесінділерді жууға арналған күкіртқышқылды су. 5 мл 10 % калий бисульфитіне (K2 S2 O5) 5 мл 1NHCl ерітіндісін қосып, дистилденген сумен 100 мл дейін жеткізеді. Калий бисульфиті ерітіндісін 7 күн пайдалануға болады, күкіртқышқылды суды қолданардың алдында дайындап, бір рет қана пайдаланады. Әдіс: Қалыңдығы 5-7 мкм парафинді кесінділерді депарафиндеп, суға дейін жеткізеді. Суық 1NHCl-мен жылдам шайып жіберу. 1NHCl-ға 600С кезінде 6 мин салу (стақанды су моншасына салады). Суық 1NHCl-мен жылдам шайып жіберіп, кейін дистилденген суда шаю. Шифф реактивіне 40-60 мин салу. Фильтр қағазымен құрғатып және жаңа дайындалған күкіртқышқылды судың үш порциясында әрқайсында 1-2 мин шаю керек. Құбыр суында 10 мин дейін шаю. Сусыздандырып, жарықтандырып, бальзамға қатыру. Нәтиже. ДНҚсы бар ядроның аймақтары қызғылт түске боялады. жүктеу/скачать 68,84 Kb. Достарыңызбен бөлісу:
|