Жоғары өсімдіктердің жасушалар культурасы

Жоғары өсімдіктердің жасушалар культурасы

Суспензиялы культуралар

Суспензиялы культуралар екіншілік метаболизм жолдарын, ферменттер индукциясын және гендер экпрессиясын, бөтен қосылыстардың деградациясын, цитологиялық зерттеулерді және т. б. Жүргізуге арналған модельді жүйелер түрінде кең қолданылады.

«Жақсы» қатар белгісі болып жасушаның метаболизмді қайта құруға қабілеттілігі және олардың нақты культивирлеу жағдайларында көбею жылдамдығы табылады. Мұндай қатардың морфологиялық сипаттамалары:

• 
  дезагрегацияның жоғары деңгейі (топта 5-10 жасуша);
  
• 
  жасушалардың морфологиялық теңестірілуі (кішірек көлемдер, сфералық немесе сопақ форма, тығыз цитоплазма);
  
• 
  трахеид тәрізді элменттердің болмауы.
  

Жасушалардың суспензиялы культураларының өсуін бір немесе бірнеше келесі параметрлер бойынша бағалауға болады:

1. Тұнбаға түскен жасушалар көлемі (ТТЖК). Көлемі 15 мл өлшегіш пробиркаға, коникалық дұрыс, сусензиялы культураның аздаған мөлшерін тасымалдайды. 200 g. 5 минут центрифугалайды. ТТЖК – суспензия көлемінен тұнба көлемін құрайтын өлшем, әдетте %-бен.

2. Жасушалар саны. Фукс-Розенталь камерасында саналады.

3. Шикі және құрғақ масса. Әлсіз вакуум астында Бюхнер воронкасына салынған, суландырылған және өлшенген фильтр арқылы жасушалар суспензиясы фильтрленеді. Жасушаларды дистильденген сумен жуады, вакуум астында суды сорады және қайтадан фильтрмен бірге өлшейді. Құрғақ масса – ұқсас анықталады, бірақ құрғақ фильтр өлшенеді, ал жасушаларды фильтрмен бірге термостатта 60^оС-та тұрақты массаға дейін құрғатады.

4. Ақуыз көлемі. Ақуызды анықтау үшін жасушаларды шыны талшықтан жасалған фильтрге жинайды, этанолдың қайнаған 70%-дық ерітіндісімен екі рет шаяды, ацетонмен кептіреді, 85^оС температурада 1М NaOH-пен бір жарым сағат гидролиздейді. Содан кейін фильтрлейді және Лоури бойынша ақуызды анықтайды.

5. Ортаның өткізгіштігі. Кондуктометр көмегімен анықтайды. Ол жасушалардың жаңа массасына кері пропорционал.

6. Жасушалардың тіршілікке қабілеттілігі. Цитоплазманың қозғалысын микроскоппен зерттеу арқылы, сонымен бірге тірі (прижизненный) бояғыштар көмегімен бағалайды. Пайдаланудан бұрын инкубационды буфердің рН-ын, бояғыштың концентрациясын, инкубация уақытын таңдайды, тірі және өлі жасушалардың қоспасына арналған калибрлі қисықтар құрастырады.

Алынған мәліметтер бойынша S-тәрізді формадағы өсу қисықтарын құрады және бірнеше бөліктерге бөледі: 1 – латентті немесе лаг-фаза, мұнда көрінетін өсу критерийлердің бірде-бірінде байқалмайды; 2 – экспоненциалды, жылдамдатылған өсу; 3 – сызықты, өсу жылдамдығы тұрақты; 4 – баяулатылған өсу фазасы; 5 – стационарлы фаза; 6 – жасушалар деградациясының фазасы.

Нақты өсу қисығы модельдіден біршама айырмашылық жасауы мүмкін. Өсу қисықтарының формасына популяцияның генетикалық сипаттамасы да, инокулят көлемі де, өсіру шарттары да әсер етеді.

Өсімдік жасушаларын терең культивирлеу үшін микробиологияда жасап шығарылған тәсілдер қолданылады. Культивирлеу жүйесінің екі түрін ажыратады: ашық және жабық.

Жабық жүйе үшін өсірудің периодты режимі тән. Жасушалық масса (инокулят) белгілі орта көлеміне енгізіледі. Жүйе өсірудің аяғына дейін, газдардан басқа барлық параметрлер бойынша жабық болады. Жаңа қоректік ортада периодты беріледі, ал ескісі тура сол мөлшерде алынып отырады. Жасушалар барлық өсіру циклі бойы жүйеде қалады.

Ашық (ағынды) культуралар жаңа қоректік ортаның берілуімен сипатталады, ол кезде тек ескі қоректік орта ғана емес, сонымен бірге жасушалық масса егінінің бір бөлігі де алынып тасталады.

Жабық культивирлеу анағұрлым жақсы зерттелген және тараған. Аэрация мен араластыру үшін түрлі аппараттарды пайдаланады: роллер, тербелмелер, магнит араластырғыштар және т. б. Жасушалардың in vitro өсуі мен биосинтезі үшін культивирлеу жүйелерінің техникалық сипаттамалары маңызды орын алады. Колбалардағы көлемі кішірек культуралардан үлкен көп литрлі ферментерларға дейін масштабтау кезінде культивирлеудің көптеген параметрлері, негізінде аэрация мен араластырғыштық өзгереді.

Өндірістік масштабтарда суспензияны культивирлеу үшін микробиологиялық өндіріске арнап жасалған аппаратура қолданылады, дегенмен соңғы жылдар зерттеулері өсімдік жасушалары өздерінің өзіндік ерекшеліктеріне қарай культивирлеу үшін арнайы ыдыстарды талап ететінін көрсетті. Өсімдіктер жасушалары бактериялар мен саңырауқұлақтардың жасушаларына қарағанда ондаған, мыңдаған есе ірі, сонымен қатар олардың көлемі онтогенез процесінде өзгереді. Егер экспоненциалды өсу фазасының басында олар ұсақ және тығыз болса, стационарлы өсу фазасында олардың көлемдері қатты үлкейеді және вакуолизденеді. Жасуша ірі болған сайын оның араластыру процесінде механикалық зақымдану қауіпі арта түседі. Сол уақытта өсімдіктің ірі әрі ауыр жасушалары дұрыс араластыруды талап етеді. Олардың тұнбаға түсуі жасушалардың тез жинақталуы мен қартаюы жүретін ыдыстарда «өлі» аймақтардың пайда болуына әкеледі.

Жұмсақ араластыру мен аэрацияны ауаның көтеріліп келе жатқан тогы бар ферментердан берілетін сығылған стерильді ауа ағынымен пневматикалық араластыру тәсілі қамтамасыз етеді. Өкінішке орай, бұл әдісте де кемшілік бар, себебі культуралды ортада оттекті ашығуға әкелетін ауаның артық мөлшері пайда болады. Ортадағы оттек концентрациясына жасушалардың өсуі мен екіншілік метаболизмі тәуелді. Микробиологиялық жүйелерде биомассаның өсуі, ізделіп отырған өнімнің шығымы және оттегімен жабдықтаудың өзара тәуелділігі зерттелген.

Жасушалардың өсуіне оттектен басқа да газдар әсер етуі мүмкін. Мысалы, көмірқышқыл газы лаг-фазаның ұзындығына әсер ете алады. Көмірқышқыл газы мен ұшқыш қоспалар жойылатындықтан, аэрацияның жоғары деңгейі екіншілік метаболизм өнімдерінің өсуі мен синтезіне кері әсерін беруі мүмкін. In vitro өсімдік жасушалары микроорганизмдермен салыстырғанда тыныс алудың төменгі қарқындылығына ие, бұл культивирлеуге арналған ыдысты жасау кезінде назарға алынуы керек.

Өсімдіктер жасушаларының суспензиялы культурасының ерекшеленетін өзгешелігі – өсу үшін қажетті жоғарғы тығыздық. Сондықтан өсімдік жасушаларын культивирлеу кезіндегі шиеленіскен жағдай болып биомасса өсуін алып жүретін тұтқырлықтың жоғарылауы табылады. Бұл адгезияға әкеледі. Культуралды ыдысты және оған орналастырылған араластырғыштар мен датчиктердің бетіндегі жасушалардың бір-біріне адгезиясы қиындық тудырады. Ыдыстың жоғарғы жағында біртіндеп жасушалардан бөлінетін ақуыздар мен полисахаридтерден тұратын көбіктер пайда болуы мүмкін. Культивирлеу процесінде жасушалар жабысады және олардың бір бөлігі осы көбікте «қабық» немесе «безе» түзіп жинақталады. Жасушалар биомассасының ұлғаюымен бірге осы «қабық» та ұлғаяды, бұл араластыру қарқындылығын төмендетеді және соңында культураны өлімге әкелуі мүмкін.

Өсімдіктер жасушаларының микроорганизмдермен салыстырғанда физиологиялық және метаболиттік белсенділігі төмен. Өсімдік жасушасының генерация уақыты микробты жасушаның генерация уақытынан 60-100 есе асады.

Периодты немесе жинақтық культивирлеу – әзірге дәстүрлі болып табылатын, жасушаларды өсірудің ең қарапайым тәсілі. Суспензиялы культураларды екіншілік метаболиттерді өндірістік алу үшін пайдаланады. Өсімдік жасушаларымен продуцирленетін заттар медицинада, парфюмерлі өндірісте, өсімдік шаруашылығында және өндірістің басқа салаларында қолданылады. Оларға мыналар жатады: алкалоидтар, терпеноидтар, гликозидтер, полифенолдар, полисахаридтер, эфир майлары, пигменттер, антиканцерогендер, пептидтер. Қазіргі уақытта түрлі мемлекеттерде өсімдіктердің жүзге жуық түрі экономикалық маңызды заттар алу үшін биосинтетикалық өндірісте пайдаланылады.

Екіншілік метаболиттер алудың өзіндік ерекшеліктері бар. Жасуша биомассасының ұлғаюына әкелетін жасушалар бөлінуі мен екіншілік метаболиттердің синтезі уақытпен бөлінген. Екіншілік метаболиттердің жинақталуы жасуша популяциясының баяулатылған өсу фазасында ұлғаяды және стационарлы фазада максимумға жетеді. Экспоненциалды фазаның соңында жасушаларға әсер ететін стресті жағдайлар екіншілік метаболиттердің синтезіне өтуді ынталандыра және олардың шығымын арттыра алады.

Жеке өсімдік жасушаларын культивирлеу әдістері

Жеке жасушаларды клондар алу, олардың генетикалық және физиологиялық өзгеруін немесе тұрақтылығын зерттеу үшін культивирлейді. Сонымен қатар, жеке жасушаларды культивирлеу популяция немесе ұлпа жасушаларының әсерінен оқшауланған жасушалардағы бөлінуге ынталанудың пайда болуын анықтайтын шарттарды зерттеуге мүмкіндік береді. Жеке жасушалар мутантты, гибридті және трансформацияланған қатарларды клонды селекциялау үшін де аса маңызды. Әдетте мұндай жасушаларды селекцияны жүргізуге мүмкіндік беретін маркерлі гендерге енгізеді.

Бұдан басқа, жеке жасушалар ұлпа және оқшауланған жасушадағы физиологиялық процестерді зерттеуде салыстырмалы үлгі ретінде қолданыла алады.

Оқшауланған жасушаларды өсіру екі кезеңнен құралады: 1) өсімдік немесе каллус ұлпасының зақымданбаған жасушасын оқшаулау; 2) оқшауланған жасушаның өсуі мен дамуына қолайлы жағдайлар жасау.

Бірінші кезеңде тұтас өсімдік ұлпасынан немесе каллус ұлпасынан зақымданбаған және тіршілікке қабілетті жасушаны бөліп алу қажет. Бұған ұлпаны оның жасушаларын мацерацияға ұшырататын пектиназалармен өңдеу арқылы қол жеткізуге болады. Дегенмен мұндай өңдеуден кейін жасушалар бөліну мен ұлпа түзу қабілеттілігін ылғи сақтап қала бермейді. Жеке жасушаларды суспензионды культуралар немесе борпылдақ каллустан алған дұрыс. Мінсіз жеке жасушалар болып жасуша қабірғасын түзген протопласттар табылады.

Осыдан кейін жасушаларды не микроманипуляторлар көмегімен, не келесі егулер жолымен оқшаулайды. Жеке жасушаларды культивирлеудің алғашқы әрекеттерінен-ақ маңызды ғылыми мәселе туындады: популяцияның немесе ұлпаның басқа жасушаларының әсерінен оқшауланған жасушаларды бөлінуге қалай мәжбүр етуге болады? Жеке жасушалар қоректік орта бетіндегі суспензия немесе каллус массасындағы агрегаттар түрінде жинақталуына қарағанда өзгерін өзгеше ұстады.

Мәселені шешу кезінде «кондиционирлеу факторы» жайлы гипотеза туындады. Осылай жеке жасушалардың бөлінуін ынталандыратын зат аталды. Бұл фактор химиялық табиғатты, термолабильді, суда еритін, төмен молекулалы, түрлік ерекше еместігі, белгілі фитогормондарды алмастырмайтыны, брассиностероидтармен синергиялы екені анықталды.

Жеке жасушаларды бөлу үшін қолайлы жағдайларды ең алғаш рет 1954 жылы Мьюир, Хильдебрант және Райкер таңдап алды. Бұл тәсіл «бағушы ұлпа» әдісі деген атқа ие болды.

Жасушаларды борпылдақ каллус микроманипуляторының көмегімен өлшемі 8 * 8 мм болатын, жасуша алынған каллус ұлпасының бетіне орналастырылған фильтр кесегіне тікелей оқшаулайды. Каллус белсенді өсу фазасында болуы керек. «Бағушы» ретінде басқа туыстас өсімдіктің каллус ұлпасын пайдалануға болады. Мұндай жағдайда жасушалар өседі және бөлінеді. Каллус – бағушының қартаюына қарай жасушалары бар фильтрді жас каллусқа тасымалдайды. Жасушадан алынған ұлпа өлшемі 0,5 – 1 мм жеткенде, оны тікелей қоректік ортаға отырғызуға болады.

«Қоректендіруші қабат» әдісін де қолдануға болады. Бұл үшін жеке жасуша алынған немесе оған жақын түрден жасушалар суспензиясын алады. жасуша суспензиясы өсу циклінің ерте экспоненциалды фазасында болуы тиіс. Бергман 1959 жылы суспензиялы культураны батистің бір қабатымен стерильді фильтрлеуді ұсынды. Нәтижесінде 90% жеке жасушалардан тұратын суспензия алынды. Алынған суспензияны құрамы суспензияны культивирлеу кезінде пайдаланылған қоректік орта құрамымен сай келетін агарлы қоректік ортамен араластырылды. Қоспа жұқа қабатпен Петри табақшасына құйылды. Агар жасушаларды бөлді, бірақ олардың арасындағы химиялық белгілермен алмасуға кедергі келтірмеді, қабат қалыңдығы олардың әрекетін микроскоппен бақылауға мүмкіндік берді.

Жеке жасушалар бөлінуінің индукциясы өте бай қоректік ортаны, мысалы Као мен Михайлюк орталарын пайдаланғанда мүмкін болады. Бұл жағдайда жасушалар орналастырылатын орта көлемі минималды болуы қажет.

Культивирлеудің аталған тәсілдерінің барлығы жасушаға кондиционирлеу факторын «сезінуге» жағдай туғызады. Ол не жеткілікті мөлшерде «қоректендіруші қабат», «бағушы ұлпа» жасушаларымен өндіріледі, не жасушалар культивирленген суспензияда болады, не болмаса ортаның үлкен көлемінде жоғалмайды.