Дәріс №1. Кіріспе. Биотехнологияның даму тарихы
Жасушаларды культураға енгізу, олардың шығу тегі
жүктеу/скачать 1,93 Mb.
|
- Бұл бет үшін навигация:
- In vitro культивирленетін жасушалар сипаттамасы
- Қоректік орталар және культивирлеу шарттары
Жасушаларды культураға енгізу, олардың шығу тегіТәжірибелік жұмыстың мақсаттары мен міндеттеріне сәйкес жануарлар жасушаларын культивирлеудің екі бағытын атауға болады: - жасушалар культуралары; - мүшелер мен ұлпалар культуралары. Жасушалар культурасының құрылымдық бірлестігі жоқ, өздеріне тән гистиотипикалық архитектурасын және онымен байланысты биохимиялық белгілерін жоғалтады және арнайы жағдайлар болмағанда тепе-теңдік күйіне жетпейді. Жасушалар культурада көбейеді, бұл жасушалардың үлкен массасын алуды қамтамасыз етеді, содан кейін оларды идентифицирлейді (фонетикалық белгілері бойынша, селективті ортада өсіру арқылы, генотипикалық), бірдей параллельдерге бөледі және, егер қажет болса, сақтайды. Культивирленетін жасушалардың динамикалық қасиеттерін көбінесе бақылау қиын, in vivo бақыланатын кейбір жасушалық өзара әрекеттерді in vitro қайта құру да қиын. Культураға енгізіліп қойған жасушалар түрлерінің саны көп. Олар адамның байланыстырушы ұлпасының элементтері (фибробласттар), қаңқа ұлпалары, қаңқа, жүрек және жұмсақ бұлшық еттер, эпителий ұлпалары, жүйке жүйесі жасушалары, эндокринді жасушалар, меланоциттер және түрлі ісік жасушалары. Жасушалар популяциялары ылғи гомогенді емес және бекітілген фенотипке ие. Эмбрионалды ұлпалардан алынған культуралар жақсы өміршеңдікпен және сәйкес ересек ұлпалармен салыстырғанда анағұрлым белсенді өсуімен сипатталады. Мұның себебі болып маманданудың төменгі деңгейі және эмбриондардағы реплицирленетін жасуша-алғылардың болуы табылады. Ересек ұлпалардың пролиферативті қабілеті төмен, оларда бөлінбейтін маманданған жасушалар саны көп. Ересек ұлпалардың біріншілік жасушаларының культурасын алу және олардың көбеюі қиын мәселе болып табылады, мұндай культуралардың әдетте өмір сүруі ұзақ емес. Қалыпты ұлпалар өмір сүру ұзақтығы шектелген культураларға бастама береді, ал ісіктерден алынған культуралар шектеусіз ұзақ уақыт бойы пролиферациялана алады. Культурадағы қалыпты жасушалардың дифференциациясы әдетте жасушалар пролиферациясының толық тоқтауымен жүреді. Ісік жасушаларының культурасында пролиферцияға қабілеттілікті сақтау кезінде ішінара дифференциация жүруі мүмкін. Жаңадан алынған культуралар отырғызу немесе субкультивирлеудің басталуына дейін біріншілік культуралар деп аталады. Біріншілік культура жасушалары әдетте гетерогенді және төменгі пролиферациямен сипатталады. Онда ұлпадан алынған жасушалар түрлері неғұрлым толық бейнеленген. Отырғызу (пассирование) культураның өмір сүруін ұзартуға, клондауға, зерттеуге және жасушалардың қасиеттерін сақтауға мүмкіндік береді. Бірнеше отырғызулардан кейін жасушалар қатары не өледі, не трансформацияланады және тұрақты жасуша қатарына айналады. Тұрақты жасуша қатарының пайда болуы морфологиялық өзгерістері, сарысуға тәуелділігінің төмендеуі, клондау тиімділігінің жоғарылауы, субстратқа тәуелділігінің төмендеуі, гетероплоидтылық пен анеуплоидтылықтың жоғарылауы және ісік тудырудың жоғарылауы бойынша констатирленеді. Қалыпты жасушалар қатерлі болмай-ақ, тұрақты қатарға трансформациялануы мүмкін. In vitro культивирленетін жасушалар сипаттамасыБір түрге жататын жасушалар ұлпада бір-бірімен әрекеттеседі және популяцияның тиісті тығыздығын қамтамасыз ету үшін бөліну уақытын үйлестіреді. Осындай түрдегі «әлеуметтік» бақылау зақымдану реакцияларында анық көрінеді. Мысалы, эпителий зақымданған кезде, ашық бет қайта жабылғанша жасушалар жараның шеттерімен бөліну және таралуға ынталанады; осы кезде пролиферация мен жасушалардың қозғалысы тоқталады. Адгезиялы байланыстар жасуша мембранасының беткі рецепторлары кешенінің түзілуімен қамтамасыз етіледі. Гликопротеидтердің көлденең қозғалысының нәтижесінде мембранада гликопротеинді кешендердің тығыз электронды түйіндіктері түзіледі. Мұндай түйіндіктер антиденелер, агглютинациялайтын агенттер немесе көрші жасушалардың әсеріне жауап ретінде түзіледі. Адгезия кезінде субстрат көп валентті антидене тәрізді әрекет етеді, ал пайда болған түйіндіктерді «адгезиялы дақтар» деп атайды. Бұл дақтар «адгезиялы ақуыздарға» бай және әрқашан гликопротеидтерді ұстап қалатын цитоқаңқа элементтерін бөледі. Мұндай әрекеттің арқасында мембрананың «сұйылуы» азаяды және жасуша дөңгелектенуден сақтанады. Жасушада түзілген адгезиялы дақтар олардың көмегімен орын ауыстыру жүретін шоқылар қалыптастырады. Цитоплазма шоқылары көрші мембранамен байланысқа түскен кезде қозғалысты ингибирлейді. Жасушалар бұл жағдайда өздерінің жалған подияларын (псевдоподии) басқа жаққа бағыттайды. Культура моноқабатты болған кезде жалғанаяқтар мен жасушалар қозғалысы тоқтайды. Қалыпты жасушалар бөлінуін тоқтатады, бұл құбылыс тығыздыққа тәуелді пролиферацияның тежелуі деген атпен белгілі. Егер мұндай моноқабатты табақшада жасушалардан бос жолақ пайда болатындай етіп инемен «жараласа», онда осы жолақтың шетіндегі жасушалар бос орынға қарай қозғалады және бөліне бастайды. Жасушалар бірыңғай моноқабатта бөлінуін тоқтататын жасуша популяциясының тығыздығы, ортадағы өсу факторларының концентрациясының өсуімен бірге жоғарылайды. Сонымен бірге, егер культуралды сұйықтық жасушалар аралымен бірге табақшаның бетінен өтетін болса, онда жаңа ғана басқа жасушалардың үстінен өткен, ортамен шайылатын жасушалар жасушалардан бос бөліктерден өткен ортамен шайылатындарға қарағанда баяуырақ бөлінеді. Жасушалар үстінен өткен ортаға кейбір маңызды қоректік заттар немесе өсу факторлары жетіспейді. Өсу факторы концентрациясы шамамен 10-10 М ортада болады. Бір фибробластта өсу факторының шамамен 105 болатындай рецепторлары бар, олардың әрқайсысы фибробластқа өте жоғары ұқсастыққа ие. Сонымен қатар, жасушалық беттің рецепторларымен байланысқан өсу факторының біршама бөлігі эндоцитоз жолымен жұтылады және бұзылады. Жайылу және субстрат бетімен бос орындарға жылжу кезіндегі жасушалар формасы да олардың бөліну қабілетіне әсер етеді. Жасушалар қатты бетке бекітілмеген және дөңгелек пішінге ие болған кезде, қалыпты жасушаларды суспензияда культивирлеуде олар ешқашан дерлік бөлінбейді. Жасушалар жайылуының пролиферацияға әсер етуін түрлі беттік адгезивтілігі бар субстраттарда немесе жасуша бекітіле алатын, бірақ жайыла алмайтын өте кішкентай адгезивті бөліктері бар субстраттарда өсірген кезде көрсетуге болады. Жасушалардың бөліну жиілігі олардың жайылу деңгейінің ұлғаюымен бірге артады. Дегенмен, суспензиядағы пролиферацияға мүлдем дерлік қабілетсіз кейбір жасуша түрлері, жасуша жайыла алмайтындай кішкентай аймақ болса да, субстрат қатысушысымен байланысқан түсу мүмкін болғанда, бірден бөліне бастайды. Мұндай «фокальді» байланыстар жасушаішілік актинді филаменттердің жасушаішілік матрикс молекулаларымен қосылыстары болып табылады. Культивирленетін жасушалардың өсу қасиеттерінің өзгерісі трансформация деп аталады. Трансформация – қайтымсыз процесс, қожайынның трансформацияланған геніне қосылатын неопластикалық фенотипті бақылайтын, тұқым қуалайтын ақпараттың маманданған бөлігінде генетикалық өзгерістер енгізеді. Өсу қасиеттерінің өзгерісі трансформацияланбаған жасушаларға қолайсыз жағдайларда, олардың пролиферациялануына мүмкіндік беретін бейімделу ерекшеліктерінің бірі болып табылады. Осылайша, қалыпты жасушалардың өсуін шектейтін жағдайларда трансформацияланған жасушалар популяцияның анағұрлым жоғары тығыздығына дейін өсетін болады, бұл олардың өсу факторларына деген төмен қажеттілігімен байланысты. Трансформацияланған жасушалар геометрикалық сипаттамалар, оның ішінде бет ауданының көлемге қатынасы онша жақсы емес жағдайларда өсуге қабілетті. Сәйкесінше, трансформацияланған жасушалар суспензиялы культураларда сфералық колонналар түзіп өседі. Осылайша, иммунологиялық толерантты жануарларға аздаған мөлшерде енгізіле отырып, трансформацияланған жасушалар ісіктер түзе алады. осы себептен трансформация кейде қатерлі өзгерістермен теңестіріледі. Трансформация не вирусты, не «спонтандық» болуы мүмкін. Көптеген зерттеулер вирусты трансформацияға ұшыраған жасушалармен жүргізілген. SV40 вирустары және полиома сияқты белгілі трансформациялайтын вирустарды пайдаланған кезде, трансформацияланған жасушалардың қасиеттері өте көрнекі көрінді және толық сипатталды. Спонтандық трансформациядан кейінгі байқалған ұқсас өзгерістер мұндай трансформация вирусты геномдағы жасушаға ұқсас, бұған дейін трансформацияланған жасуша геномында болған гендердің тізбектілігінің активация нәтижесі деген болжамға әкелді. Пролиферацияның шектеулі потенциалына, яғни мінсіз культивирлеу жағдайларында қанығудың төменгі тығыздығына ие жасушалар үшін қартаю тән. Адам диплоидты жасушаларының қатары бұған мысал бола алады. Трансформацияланған жасушалардың өсуге жоғары қабілеттілігі трансформация қартаю процесінен басым түсетінін көрсетеді. Трансформацияланған жасушалардың өмір сүру ұзақтығы шектеулі емес және бұл олардың биотехнологиядағы артықшылығы болып табылады. Қоректік орталар және культивирлеу шарттарыЖасушаларды ұлпадан немесе организмнен алғаннан және оларды культураға енгізгеннен кейін культуралды орта жасушаларда in vivo болған барлық сыртқы жағдайларды жасауы керек. Бұл жасушалардың тірі қалуын, олардың пролиферациясы мен дифференциациясын қамтамасыз етеді. Жасушадан тыс ортада жасушаларды қоректік және гормональді факторлармен қамтамасыз етуге, яғни жасушалардың өсуі мен тірі қалуына қажеттінің барлығы болуы қажет. Қоректік орта шығу тегі анықталмаған биологиялық компоненттер қосылатын, құрамы белгілі ерітінді болып табылады. Тұз ерітінділері қоректік ортаның негізін құрайды. Бұл ерітінділердегі минералды компоненттер культивирлеу процесінде ортаның тұрақты қышқыл-сілтілі балансын ұстап отыратын буферлі қызметтер атқарады. Ортаның рН тұрақтылығы культивирлеу шарттарының ең бастыларының бірі болып табылады. Қоректік орталарды дайындау үшін әдетте Эрл мен Хенкстің тұзды ерітінділері қолданылады. Дульбекко мен Фогтың фосфат тұзды буфері сияқты бұл ерітінділер де культураларды отырғызу кезінде жасушаларды суару мен шаю, жасушалар қатарын және басқа жасушалар культурасы бар манипуляцияларды алу үшін пайдаланылады. Культивирлеудің басқа маңызды шарты болып осмостық қысым табылады. Ол 1 кг еріткішке немесе 1 л ерітіндіге ерітілген заттардың осмостық белсенді бөліктерінің мольдік санымен анықталады. Жасушалар көбеюі жүретін рН пен осмомолярлық диапазондары жасушалар түріне байланысты құбылады. Көптеген орталарда рН-ты ұстап отыру үшін бикарбонатты буфер қолданылады: HCO3 = CO2 + OH, егер көмірқышқыл газы бөлінсе, онда ОН концентрациясы өседі. Ерітінділерде бикарбонатты буфердің аздаған мөлшері болуы мүмкін (Хенкс ерітіндісі), олар тығыз жабылған ыдыстарда рН-ты қалыпты ұстап отыру үшін керек. Басқаларда (Эрл ерітіндісі) бикарбонат мөлшері көп, олар СО2-нің жоғары парциалды қысымы бар жүйелерде пайдаланылады. Егер культуралар рН ұстап отыру қиын болатын СО2 инкубаторының сыртында жүргізілсе, онда альтернативті буферлік жүйелер қажет болады. Жақсы буфер болып HEPES 4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфон қышқылы табылады. HEPES суда тез ериді, екі валентті катиондарды байланыстырмайды, 0.05 Моль концентрацияға дейін цитотоксикалы емес. 0.01 0.03 М концентрацияларда қолданылады.
Дульбекконың DME немесе DMEM (Игл ортасының екі еселенген модификациясы) ортасы. Әр түрлі жасушалар түрін, соның ішінде трансформацияланбаған жасушалар мен гибридомаларды культивирлеу кезінде пайдаланылады. Сарысусыз орталар үшін негіз болып табылады. Құрамында амин қышқылдарының екі еселенген концентрациясы, глицин, серин, пируват, темір бар. Бұл ортаны қолданған кезде 10% СО2 концентрациясы бар инкубатор қажет. Исковтың IMDM ортасы – Дульбекко ортасының модификациясы. Ауыстырылмайтын амин қышқылдары, биотин, В12 дәрумені, натрий селенаты қосылған. Ортаға HEPES енгізілген және NaCl и NaHCO3 концентрациялары азайтылған. Сарысусыз орта, әдетте лимфоциттер мен қан жасушаларын культивирлеуде қолданылады. МакКойдың 5 А ортасы және RPMI орталарының сериясы. МакКойдың 5 А ортасы 1958 жылы сарысу қатысында Уолкер 256 карциносаркома жасушаларының, кейін басқа да біріншілік культуралардың және түрлі жасушалық қатарлардың клональді өсуін қамтамасыз ету үшін жасап шығарылды. Әдетте Ивкат пен Грейс (RPMI) модификациясында жүргізіледі және сарысудың қатысында лейкоциттерді культивирлеуге арналған, гибридомаларды культивирлеу үшін де пайдаланылады. Культивирлеу кезіндегі атмосферадағы СО2 концентрациясы 5%. 199 ортасы 1950 жылы балапан эмбрионынан алынған жүрек фрагменттерін культивирлеу үшін жасалды. Ортаға қоректік заттардың кең спектрі және олардың жоғары емес коцентрациясы тән. Біріншілік жасушаларға арналған ұстап тұрушы ретінде қоспасыз, ал сарысумен бірге тез көбейетін жасушаларға арналған өсу ортасы ретінде қолданылады. Қалыпты, ерекше функцияларын сақтайтын жасушалар стандартты орталарда көбеймейді (егер трансформацияланған болмаса). Жасушалардың оптималды өсуі үшін әдетте фетальды (эмбрионалды) сарысудың 5 - 20% қосады. Сарысу жасушалар өсуін шақыра да, тежей де алатын, ұсақ және ірі молекулалардың күрделі қоспасы болып табылады. Сарысудың негізгі қызметтеріне келесілер жатады: жасушалар өсуін және олардың қызметтерін ынталандыратын гормональды факторлармен қамтамасыз ету; жасушаларды бекіту және жайылу факторларымен қамтамасыз ету; гормондарды, минералды заттарды, липидтер және т. б. заттарды тасымалдайтын транспортты ақуыздармен қамтамасыз ету. Жасушалық бөлінуді ынталандыруға тікелей және ерекше қатысатын сарысу ақуыздары өсу факторы деп аталады. Өсу факторларының көпшілігі сарысу құрамында мл-ға бірнеше нанограмм және төмен концентрацияда болатын мөлшерде болады. Аталған факторлардың кейбіреуі дифференциацияның белгілі бір кезеңінде жасушалар үшін ерекше, басқалардың әрекеттері қандай да бір жасуша түрімен шектелмеген. Жасушалардың бір түрі түрлі өсу факторларымен ынталануы мүмкін. Барлық дерлік жасушалар түрі үшін өсудің басқа маңызды факторы болып инсулин гормоны табылады. Басқа гормондардан анағұрлым жиі глюкокортикоидтар, стероидтар және қалқанша безінің гормондары қолданылады. Гормондар жасуша түрі мен олардың тығыздығына байланысты өсуді ынталандырады немесе басады. Төмен молекулалы факторларды тасымалдау үшін транспортты ақуыздар қажет. Темір тасымалын трансферрин қамтамасыз етеді, ал культивирленетін жасушалардың көпшілігінің бетінде осы ақуызға арналған рецепторлар бар. Жасушаларды бекіту мен жаю факторларына коллаген және фибронектин жатады, анағұрлым маманданғандар – хондронектин және ламинин. Соңғы жылдары жасушаларды көбейтуге арналған сарысусыз орталар жасалды. Көбінесе бұл орталар тар маманданған, яғни жасушалардың белгілі бір түріне арналған. Негізгі ортаға инсулин, трансферрин, гидрокортизон немесе оның аналогі дексаметазон және т. б. қосылады. Сарысусыз орталардың артықшылықтары бар: орта құрамының жоғары тұрақтылығы салдарынан тәжірибе нәтижесінің өнімділігін жақсарту; культураның вирустармен, саңырауқұлақтармен, микоплазмамен зақымдану қатерін төмендету; жасушалық метаболизм өнімдерін тазалаудың жеңілдетілуі; биологиялық зерттеулер нәтижесіне қосымша ақуыздардың әсерін азайту; сарысудың цитотоксиндігінің болмауы. Сарысу қатысында жасушаларды культивирлеудің кемшіліктері де бар: ұлпалардың көпшілігі үшін сарысу олармен бастапқы ұлпада байланысқан физиологиялық ерітінді болып табылмайды, сондықтан, мысалы, сарысу фибробласттардың өсуін шақырады, бірақ эпидермалды кератиноцидтердің өсуін тежейді; құрамында тез пролиферацияланатын жасушалар секрециясының өнімдері болып табылатын полиаминдерге әсер ететін полиаминоксидазасы бар болғандықтан, сарысу цитотоксинді болуы мүмкін; түрлі партиялар сарысуының құрамының айтарлықтай түрлілігі; сарысу құрамында ерекше өсу факторларының жеткіліксіз мөлшері болуы мүмкін, бұл олардың жасуша культураларына қосылуын қажет етеді. Қазіргі кезде субстрат ретінде бірнеше материалдарды пайдаланады. Натрий силикатты шыны ортаны сілтілендіруі мүмкін және оны пайдаланар алдында әлсіз қышқылда қайнату қажет болғандықтан, шыныдан пирекс жақсы. Әрбір қолданылғаннан кейін мұндай шынының жарамдылығы төмендейді. Пластик – көбінесе полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон және басқаларын қолданады. Металдар – тот баспайтын болат та, титан да жарамды, аталған заттар химиялық инертті және жоғары теріс беттік зарядқа ие. Жасушалар электростатикалық өзара әрекеттер есебінен бекінеді, сондықтан культуралды ыдыстардың бетң суландырылатын және кері зарядталған болуы тиіс. Бұған қышқылдандыратын агенттермен химиялық өңдеу және физикалық әсерлермен қол жеткізуге болады. Кейде ыдыстың бетін жасушалардың бекінуін жеңілдететін затпен қаптайды. Бұл мақсатта көбінесе коллаген және полиаминқышқылдарын пайдаланады. жүктеу/скачать 1,93 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|