Омарова аккенже бердихановна

57 
қоректік ортаның бетіне қолдануға болады. Бактериялар өндіретін каталаза 
сутегі асқын тотығын суға және оттегіге бөледі, оның бөлінуі көпіршіктер 
түрінде тіркеледі. Егер бактериялар каталазды белсенділікке ие болса, онда 
бактерияларды енгізгеннен кейін 1-5 минуттан кейін қатты газ пайда болады, 
егер газ бөлінбесе каталаза түзбейді дегенді білдіреді. Лактобациллалар 
каталазаны түзбейді, демек, сутегі асқын тотығымен сынамада газдың пайда 
болуы байқалмайды.
Lactobacillus
туысына жататын бактериялардың тиістілігін анықтау ГОСТ 
10444.11-89 «Тамақ өнімдері: Граммен бояуға, қозғалысқа, спора түзілу мен 
каталазаның болуына қатысты сүт қышқылды микроорганизмдерді анықтау 
әдістері» бойынша жүргізілді. Лактобациллаларға ГОСТ 10444.11-89 сәйкес 
мынадай бактериялар жатады: грамм оң; спора түзбейтін – таяқша тәрізді 
(қысқа, шар тәріздіден ұзынға дейін); каталаза-теріс. Тығыз қоректік ортада 
колониялардың пішінін, өлшемі мен түсін бөлек белгілейді. 
Сүт қышқылды бактериялар штаммдарының сәйкестігін анықтау үшін 
100 
мл 
қайнатылған 
сүтке 
микроорганизмдер 
өсуінің 
қалыпты 
температурасынан (2-3°С) жоғары температурада сүт қышқылды бактериялар 
штаммдары мен дрожжылардан тұратын ашытқыны (3%) енгіздік. Бір мезетте 
сүттің басқа бөліктеріне ашытқы құрамына енгізілген өсінділерді қосып, 
қойыртпақ түзу ұзақтығын белгіледік. Осыдан кейін сынамаларды бөлме 
температурасында 1-2 сағатқа қалдырып, кейін +3-5°С температурада 
тоңазытқышта 16-18 сағат аралығында ұстадық. Сүт қышқылды бактериялар 
штаммдарының сәйкестігін құрамы белгілі комбинациялар мен олардың 
құрамына енген жеке сүт қышқылды бактериялардың сүтті ұйыту ұзақтығын 
салыстыру арқылы анықтадық. Сүтті белсенді штаммдар деңгейінде жоғары 
органолептикалық көрсеткіштермен ұйытқан комбинацияны іріктеп алып, 
қалғандарын ақаулық деп таныдық.
Лактобацилдердің сәйкестігін МРС-4 қатты қоректік ортасында өсіру 
арқылы анықтадық. Лайлылық стандарты бойынша сұйық қоректік ортада 
өсірілген бір күндік өсіндіні бактериологиялық ілмекпен диаметрі 3 мм етіп 
қатты қоректік ортаға енгіздік. Тамшы сіңгеннен кейін, оның шетінен 1-2 мм 
алыстатып, қоректік ортаның бетіне зерттелетін өсіндінің бірдей көлемін 
енгіздік, ол ағу арқылы шамамен алғашқы тамшының жарты бөлігін жабады.
Екінші тамшы кепкеннен кейін өсіндімен аяқшаларды төңкеріп, АҚШ-
тың индикаторы бар GasPak Anaerobe Gas Generating Pouch жүйесінің газ 
шығаратын пакеттерімен бірге 37°С температураға термостатқа қойдық. Әрбір 
тәжірибені өсінділердің орнын ауыстырып, екі қайтара жүргіздік. Бақылау тобы 
ретінде жоғарыда көрсетілген әдіс бойынша бірінің үстіне бірі егілген бір ғана 
өсіндінің 2 тамшысы қолданылды.
Нәтижелерді есепке алу 24 және 48 сағаттан кейін жүргізілді. Зерттелініп 
жатырған өсінділердің біреуінің өспей қалуы олардың арасындағы антагонистік 
қарым-қатынасты көрсетті, ал өсінділердің өзін биосәйкессіз емес түрлеріне 
жатқыздық. Өсінділердің сәйкестігі деп, олардың толық «бірігуі» кезінде 
немесе бірлескен өсіру аймағында зерттелетін штаммдардың өсуі күшейген 
жағдайда (мутуализм, синергизм, сателлизм) ғана санадық. Бір өсіндінің айқын 

58 
шеткі зоналарының болуын (өсудің тежелуі) келесі дақтың жиегі бойынша 
зерттелініп жатырған өсіндінің күшті антагонизмінің белгісі ретінде бағаладық. 
Тәжірибе үш рет қайталана жүргізілді. 
2.1.4 Сүт қышқылды бактерияларды идентификациялауда қолданылған 
заманауи молекулярлық әдістер 
Аналитикалық әдістердің көптігіне және микроорганизмдер топтарының 
кең таралуына байланысты, микробиологияда әртүрлі аналитикалық әдістер 
қолданылады.
Идентификация микроорганимздердің нақты қасиеттеріне байланысты 
олардың бір таксонға тиістілігін анықтайды.
Бактерияларды сипаттау және идентификациялау жүргізу кезінде 
олардың өсінділік, морфологиялық, жасушаларды түзу, физиологиялық-
биохимиялық ерекшеліктері, жасушаның химиялық құрамы, ДНҚ гуанин мен 
цитозиннің құрамы және басқа да фенотиптік, генотиптік белгілер 
қарастырылады. 
Микроорганимздерді идентификациялаудың негізгі әдістері 
-
Морфологиялық белгілері 
-
Ферментативтік белсенділіктері 
-
Қолмен жүргізілетін әдістер 
-
Автоматтандырылған жүйелер (Vitek,Walkaway,Phoenix) 
-
ПТР тестілері 
-
Рибосомдық РНҚ секвенирлеу (16S рРНК) 
-
Май қышқылдарының метил эфирлерін хромотографиялау 
Микроорганизмдерді биохимиялық әдістермен идентификациялаудың 
біршама кемшіліктері бар. Олар:
-
Уақыттың көп бөлігін алады 
-
Қателердің орын алуы 
-
Шығын материалдарының біршама көптігі 
-
Жұмыстың үлкен көлемімен байланысты 
Ал осы орайда микроорганизмдерді идентификациялауда қолданылатын 
заманауи молекулярлық әдістердің артықшылықтарына тоқталған дұрыс.
-
Дәлдіктің жоғарылығы және мүмкін қасиеттері 
-
Идентификацияланатын микроорганизмдердің кең спектрі 
-
Жылдамдықтың жоғарылығы 
-
Өнімділіктің жоғарылығы 
-
Зерттеудің төмен бағасы 
-
Тиімділігі 
-
Орындалуы қарапайым 
-
Қол жұмыстарының аздығы 
Бифидобактерияларды анықтау үшін фосфокетолазаны талдау әдісі 
Фосфокетолазаны 
талдау 
әдетте 
бифидобактерияларды 
ақырғы 
идентификациялау үшін жүргізіледі. Талдаудың негізі француз ұяшықтарының 
қысымы көмегімен немесе ультрадыбыспен өңдеу жолымен клетканы бұзудың 
біршама қиын үрдісі. Клеткаларды бұзу үрдісін клеткаларды алдын-ала 

59 
гексадецилтриметиламмонийбромидпен (цетримоний бромиді, ЦТАБ) жуу
құралымен өңдеу арқылы біршама тез клеткалық мембрананы бұзу үрдісімен 
алмастырады.
 
Клеткалардың әдістері екі рет (10 000×г, 4°С,15 мин) фосфатты буфермен 
(KH2PO4, 0,05 м және цистеинмен HCl, 500 мг/л) жуылып, 1:1 қатынасында 
(В/В) араластырып, рН 6,5-ке NaOH ерітіндісімен жеткізілді) және 1,0 мл 
фосфатты буферге ресуспендияланады. Жуылған бактериялық жасушалар 
алдын ала өңдеуге ұшырамады, мұзда 6 минут ішінде соникация немесе 
талдаудан бұрын 5 минут бойы ЦТАБ көмегімен инкубацияланды. ЦТАБ 
градуирленген мөлшерде жасушаның бұзылуы үшін тиімді болатын ЦТАБ 
деңгейін анықтау үшін кезекпен қосылды 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 және 0,7 
мл (450 μg/мл ерітінді).
Алдын ала өңдеуден кейін құрамына натрий фториді (NaF, 3 мг/мл) және 
калий немесе натрий иодоацетаты (5 мг/мл H2O) бар 0,25 мл ерітінді қосылды. 
Оған 0,25 мл фруктозо-6-фосфат натрий (80 мг / мл H2O) қосып, ерітіндіні 
араластырып 37°C температурада 30 мин. ұстадық. Инкубациядан кейін 1,5 мл 
гидроксиламин HCl (13 г/100 мл) қосылды, қоспаны араластырып, бөлме 
температурасында 10 мин. бойы инкубациялауға мүмкіндік бердік. Бір 
миллилитр ТСА (15%, Вт/в), 1,0 мл 4N HCl және 1,0 мл темір хлориді 
(FeCL•6H2O, 5% w/V 0,1 N HCl-ға) қосылды, пробиркаларды жақсылап 
араластырып, сапалық шкала көмегімен немесе спектрофотометрияны 505 нм 
қолдана отырып түстің өзгергені туралы мәліметті тіркедік. 
Спектрофотометриялық анықтаулар үшін тоқтатылған реакциялық 
қоспаны (10 000×g,4°C,15 мин) центрифугаладық және алынған супернатантты 
Bausch және Lomb Spectronic 70 спектрофотометрлер көмегімен өлшедік. 
Клеткалар қосылмаған реагенттері бар пробиркалар немесе фруктозо-6-
фосфаттан басқа реагенттер қосылған пробиркалар бланк ретінде қолданылды.
Фосфокетолазаның белсенділігі жоқ реакциялық қоспа ашық-сары түске 
ие болады. Егер өсінді фосфокетолазды белсенділікке ие болса, темір хлориді 
әсерінен тез арада қызыл-күлгін түс пайда болады. Қалыптасқан түстің 
қарқындылығы қолданылатын бифидобактериялардың штаммына немесе 
штаммның өсу сипаттамаларына байланысты өзгеруі мүмкін.
Ашық түсті көрсеткен штаммдар үшін, тұнба түзілу мақсатында бірнеше 
уақыт тұрғаннан кейін ғана ерітіндінің түсі айқындала түседі. Кейбір 
жағдайларда бақылау тобында ЦТАБ ерітіндісі қосылмай-ақ әлсіз түс пайда 
болуы мүмкін. Мұндай жағдай клеткаларды жуу және өте нәзік өсінділерді 
түйіршіктеу кезіндегі әлсіз лизис әсерінен болуы мүмкін деп болжаймыз.
Фосфокетолазды белсенділік бифидобактерияларда жасушалардың 
бұзылуынсыз немесе жасушалардың бұзылуына ұшыраған лактобациллалармен 
бифидобактериялар өсінділерінен байқалмаған. Барлық өсінділер жасушаларды 
бұзу үшін ультрадыбыспен өңдеу немесе ЦТАБ пайдаланылғанына қарамастан, 
түстің бірдей түзілуін берді. Жасушалық мембраналарды бұзу үшін ЦТАБ 
пайдалану жасушаларды бұзудың ұзақ дәстүрлі процедураларының тиімді 
баламасы болып табылады және фосфокетолаза талдауын пайдалана отырып, 

60 
бір мезгілде талдануы және болжамды сәйкестендірілуі мүмкін өсінділердің 
санын арттырады. 
Фруктозо-6-фосфатфосфокетолаза белсенділігін анықтау үшін, CTAB 
жасушаларын бұзу үшін пайдаланылғанын ескермегенде, қолданылған 
реагенттер мен үрдістер Scardoviмен (1981) сипатталған [99]. 
ЦТАБ немесе Cetrimonium бромиді - антисептика немесе жуғыш зат 
ретінде қолданылатын катиондық детергент. Бұл спиртте еркін ерігіш және 1:10 
судағы ерітіндісі (ЦТАБ:су). 
Масс-спектрометриялық талдау әдісі. Масс-спектрометрия-талданатын 
заттың молекулаларының немесе атомдарының массасын өлшеудің 
аналитикалық әдісі.
Масс-спектрометр-вакуум 
жағдайында 
газ 
фазасындағы 
заттың 
зарядталған бөлшектерін олардың массасының зарядқа қатынасына сәйкес 
бөлуге қабілетті аспап. 
Өсінділердің жеке колонияларын диаметрі 1-1,5 мм (5-10 мг) агар бетінен 
бір реттік ілмектердің көмегімен алып, содан кейін құрамында 50% 
ацетонитрил және 2,5% трифторуксус қышқылынан тұратын 50 мкл қоспасы 
бар 0,5 мл (Eppendorff, Германия) пробиркаларға салдық. Бактериялық 
жасушаларды абайлап 1-2 минут суспензияладық. Алынған сұйықтықты 1 
минут 14 000 айн/мин. кезінде центрифугаладық. Супернатантты масс-
спектрометриялық талдау жүргізу үшін зерттелетін үлгі ретінде қолданылды.
Осылайша дайындалған ақуыз экстракттары MALDI-TOF масс-
спектрометрия (МТР 384 massive, «Bruker Daltonics», Германия) үшін 1 мкл 
көлемінде (әрбір үлгі - үш параллельде) болаттан жасалған планшеттің 
шұңқырларына енгізілді.
Планшет ауада 3 мин. бойы кептірілді (үлгілер көзбен қарағанда кебуге 
дейін), содан кейін ақуыз сығындыларының үлгілеріне 2 мкл-ден 50% 
ацетонитрил және 2,5% трифторуксус қышқылынан тұратын a-СНСА
матрицасының қаныққан ерітіндісін («Bruker Daltonics», Германия) енгіздік. 
Аталған құрамды планшет кристалдар пайда болғанға дейін 5 минут 
ауада кептірілді.
Масс-спектрометриялық талдау Microflex («Bruker Daltonics», Германия) 
MALDI-TOF масс-спектрометрін қолдану арқылы жүргізілді. Әрбір масс-
спектрін алу үшін үлгіні десорбциялау-иондау үшін жеткілікті ең төменгі шекті 
мән деңгейінде белгіленген сәуле шығару қуаты бар лазердің 50 импульсі 
қолданылды.
Масс-спектрометр параметрлері m/z диапазоны 2000-нан 20-ға дейін 
оңтайландырылды. Көрсетілген диапазонның ішкі калибрленуі белгілі 
өсінділер ақуыздарының нақты мәндерін пайдалана отырып жүргізілді.
Үлгіні планшеттің екі ұяшығына енгіздік, олардың әрқайсысына 10 бірлік 
спектрді (500 лазер импульсі) қосу нәтижесінде алынған спектр жазылған. 
Масс-спектрлерді жазу, өңдеу және талдау үшін «Bruker Daltonics» (Германия) 
фирмасының бағдарламасы қолданылды: flexControl 2.4 (Build 38) және 
flexAnalysis 2.4 (Build 11). 
Масс-спектрлерді интерпретациялау кезінде тіркелетін шыңдардың көп 

61 
бөлігі белокты молекулаларға, ал анықталатын массалар - бүтін 
(фрагменттелмеген) белоктардың массаларына сәйкес келеді деген болжамнан 
туындады. Ақуыздарды идентификациялау тәжірибелік массалардың ақуыз 
массасының 
сәйкес 
мәндерінің 
сәйкестігін 
ExPASy-жүйе 
(http://ca.expasy.org/srs5/ көздеріне (SwissProt/Tr EMBL) сәйкес мәліметтер 
қорынан іздестіру жолымен жүргізілді.
Сынама дайындаудың техникалық үрдісі өте қарапайым. Ол үшін Петри 
аяқшаларындағы колониялар түріндегі бактериялық өсінділер үлгісінің аз 
мөлшері экстрагирлеуші ерітіндіде суспензияланады және кейін 1 минут бойы 
центрифугаланады. Спектрометриялық талдау үшін матрицамен (органикалық 
қышқылдармен) араласатын, ауада кебу кезінде кристалл түзетін планшетке 
енгізіліп кристалдану жүргізіледі. Бактериялық белоктардың молекулалары
матрица кристалдарының қалыңдығына қосылып, олардың одан әрі иондануын 
және масс-спектрометриялық талдауын қамтамасыз етеді. 
Әдістеменің 
артықшылығы жоғары сезімталдық, жылдам және 
қарапайым сынама дайындау (10-15 мин/үлгі), өлшеудің жоғары жылдамдығы 
(1 мин/үлгі), зерттеудің барлық сатыларын автоматтандыру және роботтандыру 
мүмкіндігі, пайдаланылатын материалдар реактивтерінің салыстырмалы төмен 
құны болып табылады. 
Осылайша, сипатталған әдістеме сүт қышқылды бактериялардың 
белокты профильдерді алу үшін осы тәсілді қолдануға және өсінділердің 
белокты профильдерінің шамалы түрішілік вариацияларын көрсетуге 
мүмкіндік берді.
Финляндия 
университетінің 
зертханасында 
жүргізілген 
зерттеу 
жұмыстары кезінде штаммдардың ДНҚ-сын бөліп алу үшін, сұйық қоректік 
ортада өскен бір тәуліктік сүт қышқылды бактериялары, ал бифидобактерия 
мен дрожжылардың қатты қоректік ортада өскен өсінділері Nucleo Spin® Tissue 
kit (Machery-Nagel Gmb H&COKG Germany) өндірушісінің нұсқаулығына 
сәйкес қолданылды. 
ПТР реакциясы 5xGreen or colorless Go Taq Flexi Buffer, MgCl2 ерітіндісі, 
DNA Polymerase (Promega) стандартты буферлермен және T3 Thermocycler 
DNTP ерітіндісімен жүргізілді. 
Осыған орай Протеиназа К (25 мкл бастапқы ерітіндісін 0,5 мл 
бактериялық суспензияға) және литикалық лизоцим ферменті (2 мг 1 мл-ға)
қолданылды. Ал ашытқы саңырауқұлағының ДНҚ-сын бөліп алу үшін ПТР 
буферіне салынған клетка мөлшерін 15 минут 95°С температурада қыздырды. 
Қыздырылған суспензия ДНҚ амплификациясы үшін пайдаланылды. 
ДНҚ реттілігін секвенирлеу GenBankGraphics базасындағы микробтық 
рРНҚ ретттілігінің мағлұматтары сақталған BLAST бағдарламасының 
көмегімен жіктелді.
«ДНК-сорб-АМ» («Амплисенс», Москва) хаттамасына сәйкес ДНҚ бөліп 
алу әдісі - сәйкесінше бір рет қолданбалы пробиркаларға (1.5 мл) әрбір 
сынамадан 100 мкл енгіземіз. Талдау үшін сынамаларды келесідей әдіспен 
дайындаймыз: 
 
-
егер сынамалар сұйық қоректік ортада өскен клетка суспензиясымен 

62 
сипатталса, оны алдын-ала 1-2рет жуып алу қажет: 13000 айн/мин 5 минут 
бойы центрифугалау, супернатантты құйып алып, вортексте 1 мл 
физиологиялық ерітіндімен қайта центрифугалау, екінші қайтара тағы да 
центрифугалау, кейін супернатантты төгіп тастау. 
-
егер сынамалар қатты қоректік ортада өскен колониялармен
сипатталса, оларды вортексте 1 мл физиологиялық ерітіндіде тұнбаға түсіріп, 
жоғарыда көрсетілген жағдайда центрифугалап, супернатантты төгіп тастау 
қажет.
-
дайын болған сынамалары бар әрбір пробиркаға 300 мкл лизирлеуші 
ерітінді 
қосамыз. 
Пробиркадағы 
сұйықтықты 
вортексте 
жақсылап 
араластырамыз.
-
сынамаларды термостатта 5-7 мин. бойы 65˚С температурада 
инкубациялау керек. Инкубациядан кейін 2 минуттан соң пробирканы 
вортексте араластырып, оны қайтадан термостатқа қою қажет. Инкубациядан 
соң вортексте қайта араластыру керек.
-
әмбебап сорбентті вортексте жақсылап сүзгілейміз. Әрбір пробиркаға 
жеке түтік ұшымен 25 мкл әмбебап суспендирлеуші сорбентті қосамыз. 
Вортексте араластырамыз.
-
5000-7000 айн/мин жылдамдықпен 30 сек. ішінде пробиркаларда 
центрифугалау арқылы әмбебап сорбентті тұндыру. Супернатантты құйып алу. 
-
жууға арналған ерітіндіні 500 мкл сынамаларға қосу, әмбебап сорбентті 
толық ресуспендиялағанға дейін вертекске араластыру, жылдамдығы 10 000 
айн/мин болғанда 1 мин. центрифугалау. Супернатантты құйып алу. 
-
жуу үрдісін қайталап және шөгінді сұйықтықты толығымен алып 
тастау. 
-
әмбебап сорбентті кептіру үшін шыны түтіктерді 65
0
С термостатқа 
салу. Бұл ретте пробиркалардың қақпақтары ашық болуы тиіс. 
-
пробиркаға ДНҚ элюциясы үшін 100 мкл ТЕ-буфер қосу. Вертекске 
араластырыңыз. Термостатқа 65
0
С температураға 5 мин. қою қажет. 
-
1 мин. ішінде 13000 айн/мин жылдамдықпен түтіктерді центрифугалау. 
Сынамалар тәжірибе қоюға дайын. 
Тазартылған ДНҚ 2-ден 8
0
С дейінгі температурада бір апта бойы және 
жыл бойы минус 16-дан аспайтын температурада сақтауға болады. Өндірушінің 
кепілдігіне сәйкес ДНҚ бөлу тиімділігі 50-70% құрайды. 
ДНҚ концентрациясын өлшеу: 
- Қондырғының бетін 4µl ПТР суымен тазалау 
- Екінші рет 2μl PCR H2O
- Компьютерде белгішені басу 
- Нуклеин қышқылын таңдау 
- Хабарлама: сумен тазарту OK түймесін басу 
- Сіңіргіш қағаз арқылы тазалау 
- EP 2μl буферін қосу 
- BLANK басу 
- Сіңіргіш қағаз арқылы тазалау 
- ДНҚ үлгісінің 1,5 мкл салу 

63 
- Өлшеу пернесін басу 
- Ақырында 5µl ПТР сумен тазалау. 
Зерттелініп отырған өсінділерді нақты түрге дейін ажырату үшін ПТР 
әдісімен 16S рРНК генін риботиптеу жұмысын жүргіздік. Туыстық деңгейінде 
өсінділерді анықтау мақсатында полимеразды тізбекті реакциясын кіші 16s 
РНК суббірліктің геніне арнайы іріктелген праймерлерді пайдалана отырып 
жүргізіледі. Амплификация реакциясын жалпы көлемі 25 мкл реакциялық 
қоспада, Taq полимеразаның нәтижелі жұмысына қажетті KCl және (NH
4
)
2
SO
4
тұратын 1х ПТР – буфер («Fermentas», Литва), 400 мM әрбір дезоксинуклетид 
үшфосфаттан 3 мM MgCl
2
, әрбір праймерден 10 пмоль, 10 мкл ДНК-матрицалар 
және 0,3 мкл Taq полимераза (0.3 Ед реакцияға) қолданылды. 
ДНК электрофорезі.

жүктеу/скачать 8,57 Mb.

Достарыңызбен бөлісу: