Омарова аккенже бердихановна
жүктеу/скачать 8,57 Mb. Pdf көрінісі
|
Диссертация
|
Амплификация өнімдерінің визуализациясын 10,8% – да электр өрісінің кернеулігі 6 В/см кезінде интеркалирлеуші бояғышпен- этидий бромидімен (5 мг/мл) бояғаннан кейін агарлы гельде жүзеге асырылды. Маркер ДНҚ ретінде $100-да қадаммен #SM0403 («Fermentas», Германия) коммерциялық өндірістің стандартты ерітіндісі пайдаланылды. Жолақтар ультракүлгін сәулелендіру арқылы көрсетілді. Ген фрагменттерін секвенирлеу. Өсінділер геномының белгілі бір саласындағы нуклеотидтердің бірізділігін анықтау үшін ДНҚ материалының өңделуі келесі әдістемеге сәйкес ПТР-да жүзеге асырылды. Амплификация реакциясын құрамында 1 реттік ПТР-буфер («Fermentas», Литва), 3 мМ MgCl2, 400 мМ әрбір дезоксинуклеотид трифосфаттар, 10 мкл ДНК – матрицалар және 0,3 мкл taq полимераза (реакцияға 0,3 ед) бар жалпы көлемі 25 мкл реакциялық қоспада жүргізілді. Температураны циклдеу үшін GeneAmp 9700 («Applied BioSystems», АҚШ) ДНҚ амплификаторы қолданылды. ПТР-өнімнің концентрациясын анықтау #SM0403 («Fermentas», Германия) ДНҚ маркерімен жүргізілді. Бұл ретте агарозды гельдің шұңқырына 5 мкл сынама енгізілді, жеке жолға 5 мкл ДНК-маркер жағылды. Үлгілердің гель шұңқырына баламалы енгізілуі көлем бірлігіне келетін ДНҚ санын анықтауға мүмкіндік береді. Кезекті секвенирлеу үшін ДНҚ өнімді тазалау төменгі хаттама негізінде Коммерциялық Жинақ арқылы жүргізілді. 1. ПТР өніміне 110 мкл PB қосу (қоспа) 2. QI quick colum қойып және қоспаны қосу (=130μl) 3. 1300 айн / мин / 60 сек центрифугалау 4. Элютті алып, жуу, 750 µ PE буферін QI quick colum енгізу. 5. 1300 айн / мин / 60 сек центрифугалау 6. Элютті шығарып, 2-ші қайтара жуып 750 µl PE буферін QI quick colum бағанасына қосу 7. Жуу буферінің қалдықтарын жою 8. Әрбір QIA quick бағанасын таза 1,5 мл эппендорфке қою. 9. ДНҚ элюирлеу үшін 35 мкл EB буферін қосу 10. 1300 айн / мин / 60 сек. центрифугалау 16s РНК тізбекті талдау. Зерттелетін штаммдардың 16s РНК гендерінің 64 нуклеотидті тізбектемелерінің ұқсастығын бастапқы талдау BLAST бағдарламалық пакетінің көмегімен жүргізілді. Бактериялар штаммдарының геномдық ДНҚ Mini Kit applied biosystem PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (Applied Biosystems) реагентінің коммерциялық биожүйесін пайдалану арқылы алынған. 16S рРНК генінің толық фрагментін ПТР жағдайында 616V және 630R праймерлерін пайдалана отырып амплификация жүргіздік. Амплификация термоциклердің (кәсіби градиент Thermocycler Biometra T) көмегімен орындалды, содан кейін 1,5% агарозды электрофорез (110 В, 30 минут) арқылы УК-шамның астында расталды. Тексерілген үлгілер ПТР (Qiagen) тазалауға арналған жиынтықты пайдаланып тазартылып, Sanger секвенирлеу мақсатында Gatc (Biotech компаниясы) жіберілді. 16s рРНК генінің толық реттілігі тікелей және кері праймерден алынған 2 тізбектер негізінде қайта құрылды. Осы мақсаттар үшін BioEdit v7 бағдарламасы қолданылды (мына сілтеме бойынша қолжетімді: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html). RAPD (random amplified polymorphic DNA) – кездейсоқ амплифицирленген полиморфты ДНҚ әдісі. ДНҚ маркерлерді шартты түрде үш топқа бөлуге болады: блот- гибридизацияға негізделген маркерлер, ПТР-ға негізделген маркерлер және ДНК-чиптерге негізделген маркерлер. Бұл жұмыста біз ПТР-ға негізделген маркерді қолдану арқылы бифидобактериялардың ішінде Bif.crudilactis деп танылған 4 өсінді үшін базадағы өсінділермен салыстыру мақсатында қосымша идентификациялау жұмысын жүргіздік. RAPD маркерлер – ДНҚ кездейсоқ амплификация нәтижесінде алынатын маркерлер [99]. RAPD талдау бір олигонуклеотидті праймерді пайдалана отырып, полимеразды тізбекті реакция жүргізуді қамтиды. RAPD талдау өнімдері аталмыш праймердің инвертацияланған тізбегімен қапталданған геномдық ДНҚ фрагментінің амплификациясы нәтижесінде пайда болады. Қасиеттері: - Реакциялар жағдайларының өзгеруіне жоғары сезімталдық - Күйдірудің жеткілікті төмен температурасы (37 0 С) - (көп буланбаған негіздермен амплификация өнімдерінің пайда болу ықтималдығы артты). - Rapd маркерлер өзін доминантты және олардың гетерозиготалық жағдайы гомозиготтан ерекшеленеді, сондықтан популяциялық талдау кезінде және кодоминантты маркерлермен салыстырғанда генетикалық ресурстарды сәйкестендіру кезінде бағалаудың дәлдігі төмендейді. - ПТР нәтижелерінің төмен өнімділігі. - Шынайылықты арттыру үшін үлкен таңдау қажет . Бірақ дегенмен, RAPD талдау генетикалық полиморфизмді анықтаудың өзіндік экспресс - әдісі болып табылады, бұл әсіресе аз зерттелген таксономиялық топтар үшін, сондай - ақ бірегей локус – ерекше маркерлердің көзі ретінде өзекті болып табылады. 65 ДНҚ экстракциясын бөліп алу рРНК 16s фрагменттерінің ПТР-амплификациясы үшін қолданылатын геномдық ДНҚ кездейсоқ амплифицирленген полиморфты ДНҚ (RAPD) [100, 101] хабарланған ПТР цикл бағдарламасы бойынша қайта пайдаланылды. ДНҚ экстракциясын бөліп алу «PrepMan Ultra» реагенттер жинағы хаттамасымен жүргізілді. - әрбір сынаманың 20мг мөлшерін өлшеп 2 см 3 көлемді стандартқа сай центрифугалық пробиркаларға енгізу - 400 см 3 көлемде PrepMan Ultra реагентін сынамалар бар пробиркаларға енгізу - толық араластыру мақсатында жақсылап шайқау - 100°С температурада 10 мин. бойы су моншасында ұстау - пробиркаларды 2 мин. бойы 14 000 айн/мин. микроцентрифугада айналдырамыз. - әрбір сынамадан супернатантты жаңа таза пробиркаларға енгізу. Ескертпе: супернатант әлсіз боялған болуы мүмкін. Кейде тез арада немесе сақтау кезінде лайлану байқалуы мүмкін. Бұл қосымша іс-әрекеттерді қажет етпейді. - супернатантты 20°С температурада сақтайды. Сақтау уақыты шектеусіз. Rapd-PCR параметрлері RAPD реакциясын ДНК термоциклерінде 4 мин. ішінде 96°C 1 цикл ішінде, одан кейін 94°C 1 мин ішінде 40°C, 1 мин ішінде 40°C және 2 мин ішінде 72°С жүргізілген. Амплифицирленген өнімдер 2% агарозды гельдің (USB, Cleveland, OH) электрофорезімен талданған, бромды этидиямен боялған және ультракүлгін жарықта визуализацияланған. Әрбір жолақтың өлшемі Quantity One 1-D (Bio-Rad, Hercules, CA) талдауын бағдарламалық қамтамасыз етумен анықталды. ДНҚ-ның барлық үлгілерін амплификациялау, егер ол бар болса, амплификация паттерналарында вариабельділікті көру үшін үш рет қайталанды. Осындай заңдылықтар барлық тәжірибелерде алынды. Rapd әдісімен филогенетикалық талдау профилі Rapd профильдері Bif.crudilactis штаммдарының генетикалық ұқсастығын өлшеу үшін қолданылды. Жолақтардың болуы немесе болмауы деректер матрицасында екілік (0,1) нысанда кодталған Bif.crudilactis –тің жекелеген генетикалық популяцияларының арасындағы байланыс қашықтықтың матрицасы әдісімен анықталды. Тәсіл генетикалық ұқсастықтың индексін қарастырады. жүктеу/скачать 8,57 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|