С. В. Кожанова Жалпы иммунология
жүктеу/скачать 19,87 Mb. Pdf көрінісі
|
Жалпы иммунология оқулық
| ИФТқою принщпі
ретімен жүргізілетін келесі кезеңдерден тұрады. • Қатты фазаға (полистеролды планшет ойыктарындағы) арнайы антигенді (антиденелерді аныктау үшін) немесе спецификалык антиденелерді (антигенді аныктау үшін) сорбциялайды. •Жүйеге (планшет ойыктарына) құрамында арнайы антиденелері бар биосынама (сарысу) енгізеді. • Қоспаны тиісті уакыт бойы инкубациялайды, сол кезде катты фа- задағы антигенмен антидене арасында спецификалык өзара әре- кеттесу болады. Байланыспаған компоненттері шайылып кетеді. • Ойыктарға фермент (көбінесе пероксидазалар) коспасын енгізеді; оның молекулалары түрге (микробка) карсы антиглобулиндер- мен (мысалы, адамның І§0, І£М, І§А карсы кояннан немесе ешкілерден алынған кан сарысулары) конъюгацияланған жүйені тиісті уақыт бойы инкубациялайды. Буфер ерітіндісімен шайып тастайды. • Коспаға (ойыктарға) хромогенді субстрат енгізеді. Ферменттін әсерінен антиглобулинді сарысу катализдік ыдырауға ұшырап, субстрат түсі өзгереді. • Боялу дәрежесінің интенсивтілігі бойынша визуалды немесе спектрофотометриялык әдіспен нәтижелерін тіркейді (23.5-сурет, түрлі түсті жапсырманы караныз). 524 IV Б ө л ім . И м м у н д ы п а т о л о г и я ж ә н е и м м у н д ы п р о ф и л а к т и к а Сонғы кездері өте сезімтал иммунды ферменттік талдау эдісі кенінен колдануда. Берілген әдістің қағидасы кажетті иммуноглобулиндер кла- сына карсы моноклонды антиденелерді, нәруыздарды тұракты адсорб- циялайтын, пластиктен жасалған арнайы планшеттің ойыктарына сорбциялауымен негізделген. Егер де пластиктін беті нәруыздармен каныккан болса, онда кейінгі адсорбция болмайды. Адсорбцияланбаган антиденелерді кетіру үшін ойыктарды жуганнан кейін, оған зерттелетін сарысуын кұйып, инкубациялайды. Одан сон сарысуынын байланыспаған нәруыздарынан ойықтарды жуады және пероксидаза ферментімен конъюгацияланган, адам иммуноглобулиндердін кажет кластарына карсы сарысуды енгізеді. Мұндай карсы сарысулар тек «өзінің» моноклонды антиденелерімен адам иммуноглобулиндерінін сәйкес кластары бар ойыктарда ғана байланысады. Жуып және ойыкка сутегінің асқын тотыгын және косылыстары бар субстраттарды косканнан кейін, ол тотығу нәтижесінде боялған туындыларын береді, тек белгіленген ферментпен сарысудын байланыскан ойыктарда гана бояулар аныкталады. Спектрофотометр аркылы барлык ойыктардын сарысуындағы берілген иммуноглобулин кластарының концентрация- сына тура пропорционал болатын оптикалык тығыздыкты бағалайды. Әдістің қойылуы. Стрип ойыктарына 100 мкл активтелген ерітіндіні енгізіп, 37 °С температурада 30 мин инкубациялайды. Стриптер инку- бация кезінде пластикалык пакеттерге орналастырған. Инкубациядан кейін ойыктардың кұрамын төгіп, лункаларды 3 рет негізгі буферлік ерітіндісімен шаяды. Алгашкы 2 стриптің төменгі ойыктарында 100 мкл калибрлік сынауды енгізген, калған 100 мкл талдайтын ерітілген сары- су үлгісін енгізеді және 37 °С 45 мин бойы инкубациялайды. Содан сон ойыктардың кұрамын сілкіп түсіріп, ойықтарды 3 рет негізгі буферлік ерітіндімен тез арада шайып тастайды. Барлык ойықтарға 100-ден конъюгат ерітіндісін енгізіп, стриптерді жауып, 37 °С 30 мин бойы ин- кубациялайды. Содан кейін ойыктардың кұрамын сілку аркылы түсіріп, 3 рет негізгі буферлік ерітіндісімен шайып тастайды және кұргатады. Барлык ойыктарды қолданудың алдында дайындалған кезде үстіне ал- дын ала 100 мкл ОФД ерітіндісін қосады. Стриптерді какпакпен жауып және 25-30 минут жарык жерден алыс 22±4 °С ұстайды. 50 мкл стоп- реагенттерді барлык стрип ойықтарға косады. Талдаудың нәтижесін толкын ұзындығы 492 нм тең фотометриялык тәсілімен тіркейді. Зерттелетін үлгілерде иммуноглобулиндердің концентрациясын, оптикалык тығыздык бойынша алынған нәтижесін калибрлік график- ке салу аркылы аныктайды. 2 3 -Т а р а у . И м м у н д ы қ д и а г н о с т и к а п р и н ц и п т е р і м е н ә д іс т е р і 525 Т-ЛИМФОЦИТТЕРДІҢ ФУНКЦИОНАЛДЫ БЕЛСЕНДІЛІГІН БАҒАЛАУ Лимфоциттердін арнайы митогендерге және антигендерге жау- ап кайтаруы, ондағы ДНК-ның белсенді түзілуімен байланысты лимфониттердін пролиферациясы болып табылады. Лимфоциттердін антигендерге және митогендерге пролиферациялык жауабы, осы жасушалардың жарамдылығын бағалайтын функционалдық сынама болып табылады. ЛБТС — лимфоциттердің бластты трансформациялаушы серпілісі. Бластты трансформациялаушы серпілісінде лимфоциттерді күшейту лимфоциттердің митогендермен және антигендермен жанасу нәтижесінде лимфобластқа (бөлінуге және ДНҚ-ны белесенді түрде түзетін жасуша) айналу касиетіне негізделген. ЛБТС коюында үш топ ынталандырушьшарды колданады (23.5-сурет, түрлі түсті жапсырманы караңыз): 1) аллогендік лимфоциттер немесе баска адамның лимфоциттері. Берілген серпілісті негізінен трансплантация кезінде донорды таңцағанда колданады; 2) антигенмен ынталандыру, мұнда сезімталдығы аныкталған антигендерді колданады; 3) шөптерден алынған Т-митогендер (фитогемагглютинин, конка- навалин А, лаконос митогені) және В-митогендерді (декстран сульфат, бактериялы полисахаридтер және липополисахаридтер). Клиникалык-иммунологиялык зертханаларда, көбінесе, үшінші топтағы ынталандырушылар, көбіне — фитогемагглютинин (ФГА) қолданады. ЛБТС соңғы нәтижесін екі жолмен бағалайды. Біріншісі морфологиялык талдауға негізделген. Мұнда микроскоптың астын- да бластты трансформациялауға ұшыраған жасушалардың санын есептейді. Бұл әдіс өте оңай, бірақ техникалык және субъективтік қателіктердің әсерінен әр түрлі нәтижелер береді. Екінші жолдың негізінде радиометрлік өлшеулер жатыр (23.6-сурет, түрлі түсті жапсырманы караңыз). ДНК түзілуіне кажет, лимфопит- тер дакьшына изотоппен белгіленген Н3-тимидин косады, сұйық сцинтиляциялык есептегіш аркьшы жасушалар қосылған изотоп- ты өлшейді, бір уақытта митоген косьшмаған параллелді дакылдың радиациялык белсенділігін аныктайды. Автоматтык есептегішпен тіркелген импульстің саны, стандартты митогенге лимфоциттердің пролиферативтік жауаптың белсенділігіне тікелей пропорционал- 526 IV Б ө л ім . И м м у н д ы п а т о л о г и я ж ә н е и м м у н д ы п р о ф и л а к т и к а ды. Ынталандыру жасалмаған дакылдағы Н3-тимидин қосындылар мөлшерінін ширатылған дакылдағы косындылар мөлшеріне аракатынасы, бласттык трансформациялануының айкындығын көрсетеді. Қалыпты жағдайда Т-лимфоциттер үшін күшейту индексі 10-20-ға тең. жүктеу/скачать 19,87 Mb. Достарыңызбен бөлісу:
|