65
ДНҚ экстракциясын бөліп алу
рРНК 16s фрагменттерінің ПТР-амплификациясы үшін қолданылатын
геномдық ДНҚ кездейсоқ амплифицирленген полиморфты ДНҚ (RAPD) [100,
101] хабарланған ПТР цикл бағдарламасы бойынша қайта пайдаланылды.
ДНҚ экстракциясын бөліп алу «PrepMan Ultra» реагенттер жинағы
хаттамасымен жүргізілді.
- әрбір сынаманың 20мг мөлшерін өлшеп 2 см
3
көлемді стандартқа сай
центрифугалық пробиркаларға енгізу
- 400 см
3
көлемде PrepMan Ultra реагентін сынамалар бар пробиркаларға
енгізу
- толық араластыру мақсатында жақсылап шайқау
- 100°С температурада 10 мин. бойы су моншасында ұстау
- пробиркаларды 2 мин. бойы 14 000 айн/мин. микроцентрифугада
айналдырамыз.
- әрбір сынамадан супернатантты жаңа таза пробиркаларға енгізу.
Ескертпе: супернатант әлсіз боялған болуы мүмкін. Кейде тез арада
немесе сақтау кезінде лайлану байқалуы мүмкін. Бұл қосымша іс-әрекеттерді
қажет етпейді.
- супернатантты 20°С температурада сақтайды. Сақтау уақыты шектеусіз.
Rapd-PCR параметрлері
RAPD реакциясын ДНК термоциклерінде 4 мин. ішінде 96°C 1 цикл
ішінде, одан кейін 94°C 1 мин ішінде 40°C, 1 мин ішінде 40°C және 2 мин
ішінде 72°С жүргізілген. Амплифицирленген өнімдер 2% агарозды гельдің
(USB, Cleveland, OH) электрофорезімен талданған, бромды этидиямен боялған
және ультракүлгін жарықта визуализацияланған. Әрбір жолақтың өлшемі
Quantity One 1-D (Bio-Rad, Hercules, CA) талдауын бағдарламалық қамтамасыз
етумен анықталды. ДНҚ-ның барлық үлгілерін амплификациялау, егер ол бар
болса, амплификация паттерналарында вариабельділікті көру үшін үш рет
қайталанды. Осындай заңдылықтар барлық тәжірибелерде алынды.
Rapd әдісімен филогенетикалық талдау профилі
Rapd профильдері
Bif.crudilactis
штаммдарының генетикалық ұқсастығын
өлшеу үшін қолданылды. Жолақтардың болуы немесе болмауы деректер
матрицасында екілік (0,1) нысанда кодталған
Bif.crudilactis
–тің жекелеген
генетикалық популяцияларының арасындағы байланыс қашықтықтың
матрицасы әдісімен анықталды. Тәсіл генетикалық ұқсастықтың индексін
қарастырады.
Достарыңызбен бөлісу: